人β防御素3融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析

近年来由于抗生素的不规范使用等多种原因 ,细菌耐药问题日益严重 ,人们正努力从各个方面来解决 ,其中机体天然产生的肽抗生素 (peptideantibiotics)由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们的关注。肽抗生素是一种阳离子小分子多肽 ,在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。防御素 (defensin)是肽抗生素中较为重要的一种 ,主要来源于皮肤、呼吸道等的上皮组织 ,是正常机体抵抗外界病原微生物入侵的重要防线。人 β 防御素 3(humanbeta defensin 3,hβD 3)参与人体免疫屏障 ,并因具有广谱抗菌和抗菌活性不被盐离子浓度抑制等特点而具特别的研究开发价值。提取中国人扁桃体组织总RNA ,以RT PCR技术扩增编码hβD 3成熟肽的cDNA并构建于原核表达载体pQE 80L ,IPTG诱导表达后利用SDS PAGE、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析。重组蛋白表达量达到细菌表达总量的 4 0 %。重组蛋白自表达菌包涵体中提取后 ,经亲和层析法纯化目的蛋白达到电泳纯 ,经多步透析法复性 ,在体外抗菌实验中表现出了对金黄色葡萄球菌、多重耐药金黄色葡萄球菌等的抗菌活性 。

人β-防御素3的cDNA克隆和表达载体的构建

目的 克隆人 β 防御素 3 (hβD 3 )cDNA并构建其原核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。方法 从人扁桃体组织中提取总RNA ,经RT PCR扩增编码hβD 3成熟肽的cDNA序列 ,将其克隆至pUC18载体进行序列测定 ,然后构建于新型原核表达载体pQE 80L中。结果 RT PCR扩增得到约 13 5bp的目的DNA片断 ,序列分析与GenBank中报道的编码hβD 3成熟肽的cDNA序列完全一致。 结论 hβD 3cDNA的克隆和原核表达载体的构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。

氨基酸分析仪快速测定尿中3-甲基组氨酸含量

目前尿中3-methylhistidi(?)e(3-MH)含量的测定方法,主要是采用高效液相色谱法和化学比色法测定。但以上两种方法在不同程度上仍存在某些缺陷,前者虽然分析时间短,但分析效果差,且柱前衍生操作繁杂。后者对样品预处理要求较高,测定易受外界条件影响,结果不够稳定。本文采用氨基酸分析仪在原程序的基础上加以改进,使分析时间由过去的210ml(?)缩短到56mi(?)。

烫伤大鼠肝葡萄糖激酶、肌己糖激酶活性及红细胞三磷酸腺苷含量的变化

为进一步探讨损伤后糖代谢状况，我们测定了３０％体表烫伤后大鼠不同时间的血糖和血乳酸，并比较休克期（伤后６ｈ）和高代谢期（伤后７２ｈ）的肝葡萄糖激酶及比目鱼肌已糖激酶（Ⅱ型）活性。结果显示血乳酸水平在伤后６ｈ和４８ｈ各有一个高峰，可能分别是应激和代谢紊乱的表现。血糖水平在伤后６ｈ明显升高，但６ｈ内波动很大。伤后７２ｈ肝葡萄糖激酶活性显著降低（Ｐ＜０．０５），可能与创伤后血糖升高，糖异生增强及胰岛素抵抗等现象有关。伤后比目鱼肌已糖激酶活性及红细胞三磷酸腺苷（ＡＴＰ）含量未发现明显变化。

培养的人动脉平滑肌细胞诱导高密度脂蛋白氧化修饰

目的 探讨高密度脂蛋白氧化修饰发生的机制。方法 利用体外培养的人动脉平滑肌细胞与人血浆高密度脂蛋白共同温育后 ,用琼脂糖凝胶电泳方法观察高密度脂蛋白电泳迁移率 ,紫外光分光光度法测定高密度脂蛋白共轭二烯的含量 ,利用荧光分光光度法测定其硫代巴比妥酸反应物质的量 ,用可见光分光光度法测定高密度脂蛋白的脂氢过氧化物含量。结果 人血浆高密度脂蛋白与人动脉平滑肌细胞共同培养 4 8h后 ,与天然高密度脂蛋白比较 ,其电泳迁移率明显增加 ,其共轭二烯、硫代巴比妥酸反应物质及脂氢过氧化物的含量均比天然高密度脂蛋白显著增加 (P <0 .0 1)。

小鼠脾淋巴细胞白细胞介素－3基因表达的调节

以刀豆球蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）、佛波酯（ＰＭＡ）、钙离子导入剂（Ａ２３１８７）单独或联合刺激小鼠淋巴细胞，以寻求诱导小鼠脾淋巴细胞白细胞介素－３（ＩＬ－３）基因表达的最适条件。结果表明：ＣｏｎＡ可单独诱导ＩＬ－３基因的表达，ＰＭＡ或Ａ２３１８７不能单独诱导ＩＬ－３基因的表达，而必须联合使用才能起诱导作用，三种刺激剂联合使用的诱导效果约为单独使用ＣｏｎＡ的３～４倍，ＰＭＡ与Ａ２３１８７联合刺激诱导ＩＬ－３基因表达的效果较两种刺激剂其它方式组合诱导效果要好。揭示ＩＬ－３基因的最适表达依赖于蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）的激活及细胞内［Ｃａ２＋］ｉ升高两条作用途径。

肠道喂养和肠外营养对烫伤大鼠骨骼肌19S调节复合体作用的影响

目的 探讨烧伤患者营养支持的有效途径。方法 分别利用免疫沉淀扣除法、间接ELISA法及荧光分光光度法检测肠道喂养与肠外营养烫伤动物模型的骨骼肌中 19S调节复合体的活性和蛋白表达水平及蛋白质降解速率的变化。结果 与肠外营养相比 ,肠道喂养能明显降低烫伤大鼠骨骼肌中 19S调节复合体活性和表达水平 ,减少骨骼肌蛋白质分解。结论 早期的肠道喂养 ,可以显著抑制 2 6S蛋白酶复合体系统的活化 ,从而在整体上降低骨骼肌蛋白质分解代谢 ,可能有助于烧伤患者的代谢调理。

烫伤后早期肠道喂养对骨骼肌蛋白质分解代谢影响的研究

目的 探讨烫伤后早期肠道喂养（ＥＥＦ）能否抑制骨骼肌蛋白质分解代谢。方法 给予３７％ＴＢ－ＳＡⅢ度烫伤大鼠早期（伤后２ｈ）或延迟（伤后２４ｈ）肠道喂养安素营养液，观察伤后第５天经目鱼肌总Ｔｙｒ释放率及２０Ｓ蛋白酶复合体的活性，以及血中ＴＮＦ、皮质酶水平。结果 烫伤后ＥＥＦ大鼠比目鱼肌总Ｔｙｒ释放率及２０Ｓ蛋白酶复合体活性，血中ＴＮＦ、皮质醇水平的升高程度均显著低于延迟肠道喂养组大鼠。结论

大鼠骨骼肌多催化功能蛋白酶的提取、鉴定及其抗血清的制备

为了研究多催化功能蛋白酶（ｍｕｌｔｉｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＣＰ）在负氮平衡形成中的作用，以大鼠骨骼肌为原料，提取此酶并制备其抗血清．将大鼠骨骼肌粗提物经４５％～６５％饱和度硫酸铵分级盐析、阴离子交换层析和凝胶过滤，最后从Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ层析柱上获得单一活性洗脱峰．酶活性用Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－４－ｎｉｔｒｉｎｉｌｉｄｅａｃｅｔａｔｅ作底物检测．非变性ＰＡＧＥ银盐染色显示单一区带的骨骼肌多催化功能蛋白酶，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银盐染色显示１０条亚基电泳区带，分子量在２５～３２ｋＤ之间．纯化的酶免疫兔８周后，抗血清效价达１３２，用分级盐析和离子交换层析纯化抗血清，显示单一电泳区带的ＩｇＧ．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析显示只在２５～３２ｋＤ之间出现多条亚基区带．这些结果提示已获得电泳纯ＭＣＰ及其较高特异性的多克隆抗体．

培养人动脉平滑肌细胞诱发高密度脂蛋白的氧化修饰

目的 观察高密度脂蛋白 (Highdensitylipoprotein ,HDL)经与培养人动脉平滑肌细胞 (Smoothmusclecell ,SMC)保温后发生氧化修饰。方法 HDL组分琼脂糖凝胶脂蛋白电泳 ,及其共轭二烯 (ConjugateddieneCD)、硫代巴比妥酸反应物质 (ThiobarbituricacidreactionsubstanceTBARS)及脂氢过氧化物 (LipidhydroperoxideLOOH )的测定。结果 HDL经过与人动脉SMC共培养后 ,与天然HDL(NativeHDLN HDL)比较 ,其电泳迁移率明显增加 ,其CD、TBARS及LOOH的含量均显著增加 (P <0 .0 1)。结论 HDL经过与培养人动脉SMC 3 7℃保温

重组人白细胞介素-3真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌的体内表达研究

将含有人白细胞介素-3基因(hIL-3)cD-NA的真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌,观察hIL-3基因在小鼠肌肉及体内的分泌表达情况。原位分子杂交及免疫组化结果显示注射重组质粒后,第14大重组质粒全部进入到骨骼肌细胞内并有IL-3的表达。ELISA结果显示,注射重组质粒DNA后,第21天小鼠血液中IL-3的含量最高,约有67ng/ml,第14天次之,约51ng/ml,第28天和第7天相近,约34ng/ml。生物学活性检测结果表明,实验组小鼠血清有维持IL-3依赖的TF-1细胞株生长的作用。表明重组质粒DNA直接注射骨骼肌后进入到肌细胞内并表达IL-3,进入血液,而且表达产物有生物学活性。

烫伤早期TNFα与IL-1增强骨骼肌蛋白质分解代谢作用机制的研究

目的 观察严重烫伤小鼠早期TNFα与IL 1对骨骼肌蛋白质分解代谢的影响及其机制。方法 建立包括背部及一侧后肢 18%～ 2 0 %Ⅲ度体表烫伤小鼠模型。以比目鱼肌体外温育酪氨酸净释放量反映骨骼肌蛋白质分解速率 ,观察 72h内伤肢、未伤肢骨骼肌蛋白质分解速率 ,以及血浆、伤肢、未伤肢TNFα与IL 1含量及溶酶体组织蛋白酶类活性的动态变化。结果 伤后小鼠血浆、伤肢、未伤肢TNFα与IL 1水平均显著增高 ,48h达到峰值 ,伤肢增高更为明显 ,72h已见回落。未伤肢蛋白质分解速率 48h高于正常 ,但 72h已降至正常水平 ,伤肢则在 72h明显高于正常与未伤肢 ,骨骼肌溶酶体组织蛋白酶活性与分解速率呈明显正相关。hrTNFα与hrIL 1分别对正常小鼠在体和离体比目鱼肌均可导致蛋白质分解速率与溶酶体组织蛋白酶活性增高。结论 烫伤早期TNFα、IL 1增强溶酶体内组织蛋白酶的活性导致骨骼肌蛋白质分解代谢的过度增强 ,从而造成机体负氮平衡是直接的 ,可能不受激素影响。

严重烫伤早期外源性β-羟丁酸钠、胰岛素对大鼠骨骼肌蛋白质代谢的影响

本文就外源性β-羟丁酸钠(β-HOBNa)、胰岛素(Ⅰ)对37％体表严重烫伤大鼠骨骼肌蛋白质代谢的影响进行了研究。结果为伤后第4天血清乙酰乙酸(AcAc)无明显变化,游离脂肪酸(FFA)下降,尿3-甲基组氨酸(3-MH)和伤肢比目鱼肌蛋白质分解率明显增加。伤后连续三天注入β-HOBNa可降低尿3-MH和比目鱼肌蛋白质的分解率,但对其合成无明显影响。联合注入β-HOBNa和Ⅰ未见二者有明显的协同抗蛋白质分解的效应。

严重烫伤大鼠骨骼肌26S蛋白酶复合体和19S调节复合体活性的变化

为阐明及防治烧伤后负氮平衡提供理论依据 ,在接近体内环境下于体外用免疫沉淀扣除法检测 30 %体表皮肤全层烫伤大鼠伤后第 1、2、3、5、7天内骨骼肌中 2 6S蛋白酶复合体及 19S调节复合体活性的变化。结果发现 ,从烫伤后第 2天开始 ,大鼠骨骼肌中 2 6S蛋白酶复合体及 19S调节复合体的蛋白酶活性和ATPase活性均明显增加 ,提示烧伤可激活 2 6S蛋白酶复合体系统 ,从而参与骨骼肌蛋白质的降解作用 。

β_2-微球蛋白的研究近况

随着人们对β2-微球蛋白（β2m）特性的研究的深入,临床多种疾病中,β2m的检测日益受重视。本文试就此问题综述如下:（一）β2M的理化特性β2m是机体有核细胞合成释放的蛋白质,分子量11.8kd,电泳时位于β2区,故名β2m。其等电点5.8,结晶半径1.6nm,消光系数1.98×104,沉降系数1.6s。通过第25和第81两个半胱氨酸基的二硫键将57个氨基酸连成环,不含硫氢基。

Ⅱ型糖尿病发病机制研究进展

NIDDM是一种异质性紊乱 ,遗传和环境因素均参与了该病的发生。胰岛素抵抗是NIDDM的一个早期和主要的特征 ,众多的遗传和代谢因素可导致其产生。胰岛素抵抗与NIDDM许多的代谢紊乱相关。强化的血糖、血压、血脂的治疗对NIDDM患者中、长期并发症的预防十分必要。现已开发出许多NIDDM治疗药物 ,正逐步应用于临床。

β_2-微球蛋白的研究进展

β_2m 广泛存在于血液、脑脊液、初乳、羊水、精液及尿液内。白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等一些恶性肿瘤,以及AIDS 和肾脏疾患等疾病,体液中β_2m水平明显升高。尽管β_2m 的变化无特异性,但体液中β_2m 的检测,对于一些疾病的筛选、诊断,以及疾病程度、治疗效果和预后的评估,不失为一项有用的辅助指标。本文介绍了β_2m 的特性、检测措施及其在某些疾病检测中的应用。

锤头状核酶RCP对HBV的P基因体外转录物的作用

本文根据Ｈａｓｅｌｏｆｆ和Ｇｅｒｌａｃｈ发表的锤头状核酶结构，设计合成了针对ＨＢＶａｙｗ株Ｐ基因５＇－端２３６０位点（ＧＵＣ）的核酶ＲＣＰ，其作用底物为ＨＰＶａｙｗＰ基因的翻译起始区（２１４０－２４２２区段），运用基因克隆结合体外转录的方法，评价了ＲＣＰ的切割活性，结果表明，ＲＣＰ在体外成功地切割了长为３４０个核苷酸的靶ＲＮＡ分子，这一工作为我们进一步在细胞内评价ＲＣＰ抑制ＨＢＶ全基因组复制及其基因表达的研究创造了条件。

锤头状核酶RCP在HepG 2215细胞中阻断HBV基因表达的初步研究

目的：在细胞水平上观察核酶对ＨＢＶ基因表达的作用。方法：将在体外具有切割活性的核酶ＲＣＰ的基因构建在表达载体ｐＳＶＬ中，获得重组质粒ＲＣＰ／ｐＳＶＬ，运用脂质体介导的基因转染技术将重组核酶基因引入ＨｅｐＧ２２１５细胞，并以空载体ｐＳＶＬ转染组为对照，通过固相放射免疫测定方法检测细胞培养上清的ＨＢｓＡｇ及ＨＢｅＡｇ分泌量，以此观察核酶ＲＣＰ对ＨＢＶ基因表达的影响。结果：在暂时性表达系统中，针对Ｐ基因５＇－端２３６０位点的核酶ＲＣＰ对ＨｅｐＧ２２１５细胞中ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ分泌量的抑制率分别是２６．７％、２４．８％。结论：锤头状核酶ＲＣＰ在细胞水平上能一定程度抑制ＨＢＶ基因的表达。

IL-1对烫伤大鼠骨骼肌26S蛋白酶复合体及19S调节复合体的作用

目的 :为阐明及防治烧伤后负氮平衡提供理论依据。方法 :在接近机体内环境下 ,于体外分别用免疫沉淀扣除法和间接ELISA法检测IL 1对 30 %体表皮肤全层烫伤大鼠烧伤后骨骼肌中 2 6S蛋白酶复合体及 1 9S调节复合体的活性和蛋白水平的影响。结果 :IL 1可以刺激烧伤后大鼠骨骼肌中 2 6S蛋白酶复合体及 1 9S调节复合体的活性和蛋白表达水平明显升高。结论 :IL 1对烧伤后大鼠骨骼肌中 2 6S蛋白酶复合体系统的激活具有重要作用 ,从而加强蛋白质的分解代谢 。