犬α-干扰素蛋白在不同表达载体中的生物学活性比较

根据GenBank中公布的犬α-干扰素(CaIFN-α)基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a(His标签)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a(His标签)连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×106 U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。

牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价

为了探究牛分枝杆菌Mb1230蛋白在牛结核病诊断中的应用价值,本试验利用PCR方法扩增出Mb1230基因,构建重组质粒pET-22b-Mb1230,经IPTG诱导表达后用亲和层析纯化重组蛋白,通过结核菌素皮内变态反应试验(TST试验)、IFN-γ释放试验(IGRA试验)和间接ELISA对重组蛋白的活性进行评价。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组蛋白大小与理论值相符,且能与鼠抗His的抗体反应有特异性条带;在TST试验、IGRA试验和间接ELISA中也表现出抗原活性。结果表明,重组Mb1230蛋白具有良好的B细胞活性和T细胞活性,在牛结核病诊断中具有应用潜力。

不同类型CpG基序对细粒棘球蚴Eg95抗原的免疫增强作用研究

为探究不同类型CpG基序对细粒棘球蚴(Echinococus granulosus)Eg95抗原的免疫增强作用,将pET-32a-3Eg95重组大肠杆菌,经IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白pET-32a-3Eg95。将重组蛋白分别与常规佐剂Quli-A、pUC18-CpG和CpG ODN混合制备基因工程亚单位疫苗样品,免疫小鼠。通过间接ELISA方法检测抗体水平,通过实时荧光定量PCR方法测定体外刺激试验后细胞因子的相对表达量,检测不同佐剂在体液免疫和细胞免疫方面对Eg95抗原免疫效果的增强作用。结果显示,诱导表达重组蛋白的大小约为56ku,与理论值相符,用羊细粒棘球蚴阳性血清检测有特异性条带;pUC18-CpG组和CpG ODN组小鼠免疫后14、28、42d的抗体平均水平(D450nm)分别为3.10、3.03、3.22和2.98、3.12、3.27,与Quli-A组抗体平均水平相比均差异显著(P<0.05);CpG ODN组血清中抗体平均水平略高于pUC18-CpG组,但差异不显著(P>0.05)。重组蛋白刺激后pUC18-CpG组与CpG ODN组IFN-β、IFN-γ和TNF-α的相对表达量分别为6.88、2.35、6.28和5.03、2.85、7.07,与Quli-A组相比差异均显著(P<0.05)。因此相对于常规佐剂Quli-A,pUC18-CpG和CpG ODN在体液免疫和细胞免疫方面对Eg95抗原都有显著的免疫增强作用,CpG ODN的免疫增强作用略优于pUC18-CpG,二者均可作为免疫佐剂,增强现有包虫病基因工程疫苗抗原的免疫效果。

检测牛IFN-γ双抗体夹心ELISA的建立及在牛结核病诊断上的初步应用

本研究旨在建立牛IFN-γ体外释放法,为牛结核病的免疫学诊断提供一种快速、有效的新检测技术。分别以获得的牛IFN-γ单克隆抗体Bo-mAb1作为捕获抗体,以Bo-mAb2H作为检测抗体,建立了基于双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)的牛IFN-γ体外释放法。该方法的最低检出限为3.12ng·mL-1,可特异性检测出重组牛IFN-γ(Bac-BoIFN-γ)及天然BoIFN-γ,而与猪、犬、鸡的天然IFN-γ无交叉反应。批内、批间变异系数小于5.11%。临床检测结果显示,与结核菌素皮内变态试验(TST)、进口BovigamTM试剂盒检测的符合率分别为88.7%和95.3%。结果表明,DAS-ELISA法具有良好的敏感性、特异性及精确度,可用于临床样品的检测,为监测牛结核病特别是其早期感染提供了强有力的检测技术手段。

综采工作面集中控制技术的设计与使用

基于PLC控制器以及KingView技术设计综采工作面的集中控制平台,并从系统设计、硬件选型、软件设计三方面进行了详细分析和讨论。集中控制平台可以实现综采工作面设备的自动化运行、单系统运行以及单机运行,已经通过工业性试验,并在煤矿井下使用,使用效果较好,达到综采工作面减人、无人的预期设计目标。

牛分枝杆菌TB9.8蛋白的表达及其诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞因子的分泌

为研究牛分枝杆菌TB9.8蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7的生长及分泌细胞因子的影响,本研究将编码牛分枝杆菌TB9.8蛋白的基因克隆于pET-30a质粒中并在E.coli中进行表达。经SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达的重组蛋白(rTB9.8)约9.8 ku,具有良好抗原性。以不同剂量的纯化rTB9.8刺激巨噬细胞RAW264.7,采用动态实时细胞检测技术分析rTB9.8对RAW264.7生长影响的最佳时间点和最佳剂量,结果表明rTB9.8可以在8 h^24 h对RAW264.7细胞的增殖产生明显的抑制作用。此外,rTB9.8能够显著诱导RAW264.7细胞表达TNF-α、IL-6和IL-12。本实验为进一步研究牛分枝杆菌rTB9.8与宿主细胞相互作用提供了实验依据。

具有边界限制的线性折返式电流限产生电路

提出了一种随温度折返式变化的电流限产生电路。该电路能起到系统级过温保护的作用。采用NTC热敏电阻来采样温度的变化信息,再放大后转换成电流,以便动态并线性地控制电流限。利用内嵌的多环路控制策略,动态引入边界限制调整环路,实现电流限的上限和下限箝位。基于标准0.35μm CMOS工艺,对折返式电流限电路进行了实现与验证。仿真结果表明,当NTC热敏电阻上的电压大于500mV或小于350mV时,电流限设置电压分别维持在500mV(上限)和250mV(下限);当NTC热敏电阻上的电压在350~500mV之间变化时,电流限电压会在上限与下限值之间随温度线性变化,变化率为1.67mV/mV。

抗犬细小病毒单链抗体的制备

提取分泌犬细小病毒的杂交瘤细胞株3H9的总RNA,反转录获得c DNA链,并以此为模板扩增重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因,利用SOE PCR方法连接VH基因和VL基因,同时引入(Gly4Ser)3连接肽序列,扩增得到大小为765 bp的单链抗体(Sc Fv)基因。将Sc Fv基因连接至原核表达载体p ET-32a(+),构建成重组质粒p ET-32a-Sc Fv,转化至BL21(DE3)感受态细胞,并在37℃条件下进行IPTG诱导表达,得到融合蛋白。经SDS-PAGE分析大小约为46 ku,与预期结果相符。经Western-blotting鉴定,该蛋白能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别。间接ELISA试验以及中和试验结果表明,Sc Fv能够与犬细小病毒结合,具有中和犬细小病毒的活性。本试验成功构建了抗犬细小病毒单链抗体,并获得了高效表达。