高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术的研究进展

高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术(简称正糖钳技术)已被公认为测定胰岛素敏感性的金标准,并在糖尿病及其治疗药物的研究中得到日益广泛且深入的应用。该技术通过同时输注外源性胰岛素与葡萄糖,升高血浆胰岛素水平,同时维持血糖在基础稳态水平。该技术减少了内源性因素对实验的影响,具有准确可靠、重复性好、避免低血糖发生等优点。现介绍该技术的原理、方法、应用等,以促进该技术在我国的进一步完善、发展及应用。

核酸杂交酶联桥接分析系统定量分析寡核苷酸

建立了基于核酸杂交及连接酶和核酸内切酶的酶联桥接分析(ELBA)系统,用于生物基质中反义寡核苷酸(ODN)药物的定量分析。对ELBA系统中的亲和素包被、俘获探针/检测探针浓度、T4DNA连接酶及S1核酸酶用量、碱性磷酸酶底物反应时间等条件进行了优化,确定使用中性亲和素包被的酶标板,俘获探针与检测探针浓度比为2∶3,S1酶为40U/孔,显色15min为最优条件,并考察了生物基质效应和稀释效应对方法的影响,建立了猕猴血浆中反义寡核苷酸的定量方法,并进行方法学确证,方法学定量范围为0.10～6.25nmol/L。本方法成功应用于反义硫代寡核苷酸药物在低剂量(1mg/kg)静脉滴注后的药代动力学研究,成为生物基质中寡核苷酸类药物定量分析的有效手段。

聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的药代动力学与组织分布研究

目的研究聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)在动物体内的药代动力学与组织分布。方法猕猴给予不同剂量(30、100和300μg/kg)的PEG-rhG-CSF,酶联免疫吸附法(ELISA)测定猕猴血浆中PEG-rhG-CSF浓度;[125I]标记示踪法结合分子排阻色潽法观察PEG-rhG-CSF在Wistar大鼠各组织中的分布情况。结果猕猴单次sc PEG-rhG-CSF后血药浓度及系统暴露随给药剂量呈非线性增加。低、中、高剂量组达峰时间(Tmax)为6.67～12.00h,全身清除率(CL)顺序减小,药-时曲线下面积(AUC)与给药剂量不成正比。sc给药的绝对生物利用度为47.5%。与临床使用剂量的rhG-CSF(10μg/kg)相比,猕猴sc中剂量PEG-rhG-CSF后Cmax、AUC分别为(1671±357)μg/L和(45 156±9407(μg.h)/L,均明显高于rhG-CSF组(P<0.05);PEG-rhG-CSF组的T1/2β为(13±3)h,较rhG-CSF组的T1/2β(1.52±0.08)h显著增加(P<0.05);而CL为(2.3±0.5)ml/(h.kg),较rhG-CSF组的CL(19.6±2.4)ml/(h.kg)显著降低(P<0.01)。大鼠sc[125I]PEG-rhG-CSF后血清、肾、肺等组织放射性较高,2 h血清原形药物浓度达峰,肺、肠道、膀胱等组织在给药后分布较慢,8 h放射性达峰值。尿液中主要为小分子[125I]降解代谢产物;未观察到药物与血浆蛋白的结合。结论将rhG-CSF进行PEG化修饰可以显著降低系统清除率,延长体内半衰期,增加药物暴露,可达到长效目的。药物主要分布于血管床,并代谢为小分子从泌尿系统排泄,不易透过血脑屏障。

聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子对猕猴辐射致粒细胞减少症的治疗作用

目的研究聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhGCSF)对猕猴辐射致粒细胞减少症的治疗作用。方法正常雄性猕猴全身一次性双侧照射60Coγ3.0 Gy,24 h后一次性sc给予PEG-rhGCSF 30,100和300μg·kg-1,及连续10 d rhGCSF 10μg·kg-1。检测50 d内的外周血象和骨髓造血细胞的情况。结果猕猴接受照射后,外周血白细胞及绝对中性粒细胞(ANC)迅速下降,造成粒细胞减少症。给药后1 d,PEG-rhGCSF治疗组均出现一过性ANC动员峰,且峰值与剂量呈正相关。PEG-rhGCSF可延缓ANC达谷时间且可以提高谷水平。与照射模型组的(7.2±2.5)d相比,PEG-rhGCSF 30,100和300μg·kg-1组抗生素需求天数3.2±2.9,1.4±1.9和(0.2±0.4)d明显缩短(P<0.05);与rhGCSF组粒细胞减少症持续时间(28±7)d相比,PEG-rhGCSF 100和300μg·kg-1组分别为(19±14)d与(7±6)d显著缩短(P<0.01)。连续注射rhGCSF 10 d与单次注射PEG-rhGCSF的药效作用相当。结论 PEG-rhGCSF对猕猴辐射致粒细胞减少症有明显治疗作用,可促进骨髓粒系增殖、分化成熟以及释放,恢复造血功能。治疗作用呈良好量效关系,与rhGCSF相比具有明显长效作用。

两种基于RAJI细胞的抗CD20单抗新型定量方法的比较及在药物代谢动力学中的应用

建立和比较基于RAJI细胞的流式细胞法(Flow cytometry assay,FCA)和细胞放射免疫法(Immuno-radiametric assay,IRA)测定重组抗CD20人源化单克隆抗体(r-anti-CD20zumAb)的浓度。两种方法均利用标记后抗体和被检测抗体竞争性结合RAJI细胞表面的CD20抗原,由标记后抗体的荧光或放射性变化而间接反应检测抗体的浓度。FCA和IRA定量范围分别为0.1～100mg/L和0.04～20mg/L,FCA的日内及日间精密度分别小于4.0%和3.0%,准确度为-1.7%～1.1%,IRA的日内及日间精密度值均小于7.0%,准确度为-8.9%～13.2%。方法学确证研究表明,两种方法均具有良好的特异性、灵敏度、精密度和准确度。血浆样品分析结果显示,两种方法具有良好的一致性,是检测猕猴血浆中人源化单克隆抗体浓度的理想方法。

毕赤酵母电转化方法的探索

旨在通过优化转化条件提高毕赤酵母电转化效率。采用不同的酵母细胞预处理液成分及浓度、不同的细胞体积、不同的质粒DNA用量,在不同的电压下进行转化,计数转化后在平板上产生的克隆数,通过计算每微克DNA获得的克隆数来评价转化效率。研究表明,用0.1 mol/L LiAc,0.01 mol/L DTT,0.6 mol/L sorbitol,0.01 mol/L Tris-HCl处理细胞可获得最佳转化效率;质粒DNA用量为10 ng时转化效率最高。使用0.1 cm电转杯,采用0.6 kV电压,对80μL细胞进行转化,转化效率最高,可达9.6×105/μg DNA;而使用0.2 cm电转杯,采用1.1 kV电压,对150μL细胞进行转化,转化效率最高,可达8.8×105/μg DNA。采用优化后条件,用10μg pPIC9K质粒DNA转化GS115,可获得1.1×106个转化子。此外通过对3种常用毕赤酵母载体转化效率的比较,发现pPIC9K的转化效率约是pPICZαA的160倍,是pGAPZαA的2 900倍。采用优化后的转化条件,毕赤酵母的电转化效率从103-4提升到了106。采用单个电转杯最多可获得1.1×106个转化子。

两种重组抗CD20人源化单克隆抗体定量分析方法的比较及其在药代动力学研究中的应用

采用酶联免疫吸附分析（ELISA）与基于Wil2-S细胞的流式细胞术（FCA）两种方法对生物基质中的重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh-anti-CD20zumab）进行定量分析,并对两种方法进行系统比较.方法学验证结果表明,两种方法均具有良好的特异性、精密度和准确度,但定量范围存在明显差异.ELISA法批内和批间精密度均小于19.5％,准确度为-18.2％～17.6％;FCA法批内和批间精密度均小于19.0％,准确度为-18.9％～ 18.4％.二者定量范围分别为0.04～5.0 mg/L和3.1～200 mg/L,ELISA法的灵敏度显著高于FCA法.利用两种方法测定猕猴静脉滴注rh-anti-CD20zumab后的血药浓度-时间变化并进行药代动力学（PK）分析.结果表明,在给定剂量下,通过两种方法获得的PK结果具有良好的一致性.FCA法是一种细胞表面抗原靶向性抗体类药物PK研究及药效动力学（PD）研究的快捷、理想的方法.

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的药代动力学和组织分布

目的研究重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)的药代动力学和组织分布。方法恒河猴单次静脉滴注rhTRAIL1,5和25mg.kg-1及iv5mg·kg-1后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定rhTRAIL在恒河猴体内的血药浓度,并采用放射性核素示踪技术结合三氯乙酸(TCA)沉淀和分子排阻高效液相色谱法测定[125I]rhTRAIL在荷瘤裸鼠组织内的含量。结果恒河猴单次静脉滴注rhTRAIL1,5和25mg·kg-1后,各剂量组的药代参数除cmax和AUC以外,均无显著差异,表现出线性动力学性质。恒河猴每天给药1次,连续7d,药物在体内没有蓄积。恒河猴静脉滴注和iv给药对药物的体内清除过程无明显影响。[125I]标记rhTRAIL后的放化纯度大于98%。荷瘤裸鼠iv给予[125I]rhTRAIL后,在各组织广泛分布,总放射性在肿瘤组织中于给药后2h达到高峰,在其他大部分组织中于给药后10min达高峰。给药后10min及2,8和24h,肿瘤/血清的酸沉放射性比值分别为0.07±0.01,0.62±0.17,0.78±0.57和1.66±0.50;给药后24h,肿瘤组织的放射性浓度高于其他组织和血清。结论在研究剂量范围内,rhTRAIL在恒河猴体内表现为线性动力学。[125I]rhTRAIL给药后在荷瘤裸鼠中广泛分布,在肿瘤组织中分布浓度较高,并主要经肾脏排泄。

新型抗氧化肽SS31体外辐射防护作用及其机制的初步研究

为探讨新型抗氧化剂SS31在体外对细胞的辐射防护作用和初步机制,用60Coγ射线照射细胞,用不同浓度的SS31对细胞进行干预,观察照射后细胞的增殖、生存状态、细胞内ROS水平和线粒体膜电位的改变,并将药物干预组和阴性对照组进行比较。结果发现:7.5 Gy的γ射线照射后24–72 h,细胞增殖活性显著降低;48 h内细胞凋亡和坏死比率显著增加,并伴随胞内ROS增长、线粒体膜电位下降和细胞周期阻滞。SS31能明显改善这些反应,药物干预组与阴性对照相比有统计学差异。通过本实验,观察到了SS31具有明显的体外辐射防护作用,提示其有潜力作为一种新型的辐射防护剂。

重组人尿激酶原临床Ⅰ期药代动力学研究

目的:研究健康受试者单次静脉注射重组人尿激酶原(rhproUK)后的药代动力性质。方法:采用ELISA分析方法测定血浆总uPA、sc-uPA抗原浓度以及联合免疫生色底物法测定纤溶活性变化。结果:健康受试者单次静脉注射给药剂量分别为20、40和60mg,血浆uPA、sc-uPA和纤溶活性的AUC和Cmax呈剂量依赖性增加,剂量比为1∶2∶3,AUCuPA之比为1∶2.1∶3.3;AUCsc-uPA之比1∶1.9∶2.9;不同给药剂量组间的uPA、sc-uPA抗原浓度的CLS、VSS、MRT、末端t1/2和tmax等参数无统计学差异。血浆纤溶活性浓度时间曲线的AUC和Cmax随剂量增加而增加,但表现出一定的非线性变化趋势,Cmax之比为1∶2.3∶3.9,AUC之比为1∶2.9∶4.7,CLS与Vd随剂量增加而逐渐减少。结论:健康受试者个体口服20～60mg剂量rhproUK后,血浆总u-PA、sc-uPA抗原浓度变化表现为线性药代动力学;而血浆纤溶活性浓度表现出非线性药代动力学特点。

新型宫颈癌治疗性疫苗肿瘤杀伤作用

目的研究新型治疗性疫苗NTV的体内外宫颈癌杀伤作用。方法采用51Cr释放法研究脾淋巴细胞对宫颈癌细胞TC-1的体外杀伤活性,将正常小鼠体内激活的免疫活性细胞输给荷瘤小鼠,采用过继性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)转移实验研究CTL的体内抗肿瘤作用。结果 CTL杀伤实验设置的效应细胞与靶细胞数量比分别为3:1、10:1及30:1,51Cr释放分析结果显示,疫苗NTV能够显著诱导脾淋巴细胞的肿瘤特异性杀伤作用,杀伤作用呈剂量依赖性变化,杀伤效率最高可达到53.5%;疫苗NTV在过继性CTL转移实验中的肿瘤抑制率为64.7%,上述结果均与阴性对照组有统计学差异(P<0.05)。结论疫苗NTV在体内外对宫颈癌细胞均具有良好的杀伤作用。

基于抗CD20单克隆抗体的2种夹心ELISA法的建立

目的：建立和比较2种灵敏、特异的夹心ELISA方法，用于准确定量检测食蟹猴血浆中重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh—anti—CD20zumab）浓度。方法：以rh—anti—CD20zumab为基础，分别用山羊抗人IgGF（ab＇）2抗体和驴抗人IgG Fc抗体包被96孔酶标板，加入待测样品，均采用HRP标记的猴血清吸附的山羊抗人IgG抗体进行检测，加底物显色，读取D450nm值。结果：建立了2种定量检测rh—anti—CD20zumab的夹心ELISA方法并进行了确证，样品的前处理分别为1：20和1：10，方法的线性范围分别为40～5000和40～12500ng／mL，定量下限均为40ng／mL，两者的板内、板间精密度分别小于16.2％和19．4％，准确度分别为-10．3％～16．6％和-14．4％～12．9％。2种方法均具有良好的特异性和稀释线性，且都未出现钩状效应。结论：方法学确证表明，本研究建立的2种ELISA法均符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则的要求，可用于rh—anti—CD20zumab的检测，为后续rh—anti—CD20zumab在食蟹猴体内的药代动力学研究提供了不同的检测方法。

不同肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白N-糖基化修饰糖链的初步分析

目的建立基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,并比较不同肿瘤坏死因子受体(TNFR)-Fc融合蛋白N-糖基化修饰差异。方法用肽-N-糖苷酶F释放糖蛋白中的修饰糖链,有机溶剂沉淀蛋白后,利用还原胺化反应将2-氨基苯甲酰胺标记至糖链上,并通过亲水作用萃取柱除去过量标记试剂,所得糖链采用ZIC-HILIC亲水作用色谱柱结合离子阱质谱进行分析。以市售TNFR-Fc融合蛋白为标准品,优化影响标记效率的各种因素后,对A和B两种TNFR-Fc融合蛋白制品的N-糖基化修饰糖链进行了分析和比较。结果 TNFR-Fc融合蛋白A和B中的修饰糖链主要含有岩藻糖、末端唾液酸、末端半乳糖、末端N-乙酰葡糖胺等糖型,且末端唾液酸含量相近,但融合蛋白A的岩藻糖和末端N-乙酰基葡萄糖的含量显著高于融合蛋白B,而融合蛋白B末端半乳糖含量高于融合蛋白A。结论成功建立了基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,该方法可有效分析糖蛋白中的修饰糖链类型和含量比例,对于详细表征糖蛋白药物结构及性质具有参考价值,并为进一步研究糖基化对糖蛋白药物药理活性以及药代动力学研究奠定了良好基础。

活体电穿孔法辅助HE4基因免疫小鼠制备单克隆抗体

目的：采用电穿孔辅助DNA免疫方法制备小鼠抗人附睾蛋白4（HFA）单克隆抗体（mAb）并对其生物学特性进行鉴定。方法：利用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）从卵巢癌患者组织中获得人HFA基因编码序列，将其亚克隆至pPICZαA表达载体中并测序鉴定。采用活体电穿孔法免疫BALB／c小鼠。单抗制备采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，经多次克隆化培养，筛选出特异分泌鼠抗人HFAmAb的杂交瘤细胞株。采用Westernblot，Ig亚型分析和mAb表位分析等对mAb的生物学特性进行鉴定。结果：获得2株持续、稳定分泌鼠抗人I-IFAmAb的杂交瘤细胞株，命名为1—7-C和3-12-C。ELISA和Westernblot结果均显示本实验获得的2株mAb能够特异识别有天然构象的HFA蛋白，2株mAb的Ig亚类均为IgM，轻链均为入链。结论：成功地构建了pPICZαA-HE4表达载体，并获得2株鼠抗人HFA杂交瘤，其所分泌的抗体能特异地识别HFA蛋白。

抗体类药物的生物分析方法研究概况

抗体类药物因其靶向性、高度特异性、低毒性等优点成为临床治疗众多疾病的首选药物,但在生物体内的处置机制有其特殊性和复杂性,极大地增加了生物检测的难度,因此必须建立灵敏、准确、可重复的测定方法。本文主要针对该类药物的生物分析方法,介绍酶联免疫吸附分析、电化学发光技术、液质联用技术、流式细胞术以及一些新技术方法的特点和应用概况,以期为研究此类药物提供参考。

比格犬血浆中德谷胰岛素浓度检测方法的建立及应用

目的建立测定比格犬血浆中德谷胰岛素浓度的液质联用(LC-MS/MS)方法,并用于其药代动力学研究。方法血浆样品经蛋白沉淀提取,流动相为乙腈-水(均含0.1%甲酸),液相分离采用Peptide ES-C18(50 mm×2.1 mm,2.7μm)色谱柱以梯度洗脱进行,通过配备电喷雾源的串联质谱,以多反应监测模式进行正离子检测,并考察了检测方法的专属性、线性、定量下限、准确度、精密度、提取回收率、稳定性及基质效应等。结果德谷胰岛素在2.00~500 ng·mL^-1与峰面积线性关系良好(r^2>0.990),定量下限为2.00 ng·mL^-1;方法的批内及批间的准确度和精密度均良好,提取回收率为66.9%~67.7%;基质效应为64.5%~79.0%,含0.2%全血的溶血基质对德谷胰岛素检测浓度无影响;样品在血浆中的稳定性良好。结论本方法简单、快速、灵敏及稳定性好,可用于测定血浆中德谷胰岛素的浓度。

2种重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的临床生物等效性评价

目的:比较2种生产基地来源的注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFRIIFc)在中国健康志愿者体内药动学(pharmacokinetics,PK)特征,并评价二者的相似性。方法:24名男性健康受试者进行随机、开放、双周期两制剂交叉试验,采用经方法学验证的酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测血清中药物浓度。Win Nonlin软件非房室模型计算PK参数,并参照生物等效性标准评价受试品(T)与参照品(R)的主要PK参数相似性。结果:本研究建立的测定人血清中TNFRII-Fc浓度的ELISA方法学指数均符合生物制品PK研究的要求。T与R的AUC0-480 h分别为(356.00±55.00)与(396.61±69.66)μg·h·mL^(-1);相对生物利用度F(T/R)为89.90%;Cmax分别为(1.70±0.50)与(1.90±0.50)μg·mL^(-1);各末端相相关PK参数相似。T的AUC0-480 h与Cmax90%置信区间分别落入R的84.10%~96.30%与78.50%~95.30%范围内。结论:研究涉及剂量下,2种产地来源的TNFRII-Fc的临床PK行为相似,可达生物等效。

rsTRAIL药代动力学及药效学研究

目的:研究rsTRAIL在动物体内的组织分布、药代动力学和抗肿瘤作用。方法:采用同位素标记示踪法结合三氯醋酸(TCA)沉淀法研究rsTRAIL在荷瘤小鼠体内的组织分布及粪尿排泄,采用ELISA法测定猕猴血清中rsTRAIL浓度。结果:荷瘤小鼠iv给药后尿液和肺中酸沉放射性最高,皮下肿瘤放射性分布较低,而脑和骨髓最低。猕猴iv注射高、中、低3个剂量(1,5和25 mg.kg-1)rsTRAIL后,AUC0～t分别为(3.7±0.1),(19.7±0.8)和(103.9±5.2)μg.h-1.mL-1,末端t1/2分别为(28.3±1.0),(31.0±0.7)和(33.2±0.9)min。裸鼠肿瘤模型显示该药具有良好的抗肿瘤作用,抑瘤率达到86%。结论:猕猴iv注射不同剂量rsTRAIL后,在给药剂量范围内基本呈线性药代动力学;荷瘤小鼠iv给药后主要经尿排泄,不易通过血脑屏障。rsTRAIL具有良好的体内外抗肿瘤活性。

高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术在比格犬中的建立及应用

目的在比格犬中建立高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术。方法以5只健康比格犬为实验对象进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验,考察血糖、胰岛素、C肽及胰高血糖素等指标。结果成功将血糖控制在目标水平,变异系数小于5%;实验过程中血清胰岛素最后稳定在(40.0±3.8)mIU/L,显著高于基础胰岛素水平;血清C肽浓度显示内源性胰岛素受到了明显的抑制,胰高血糖素没有显著升高。结论在比格犬体内建立高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术,并将其成功用于胰岛素制剂药效学的评价。

ELISA法测定食蟹猴血清中抗BLyS抗体的抗药抗体

目的:建立测定食蟹猴血清中抗BLyS抗体抗药抗体(ADA)的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法并进行验证,用于测定该药的抗药抗体。方法:在96孔板中包被治疗药物,以捕获食蟹猴血清中的抗药抗体,之后加入生物素标记的治疗药物与被捕获的抗药抗体结合,最后用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联试剂作为检测试剂。以羊抗人的IgG作为对照品,对食蟹猴血清中的抗药抗体进行半定量。结果:筛选判断阈值信噪比(SNR)为1.158,批内批间精密度小于20%,样品复孔A值变异小于20%,确证判断阈值为38.4%游离药物抑制率。抗BLyS抗体连续给药13周食蟹猴体内产生抗药抗体。结论:成功建立、验证并应用该方法测定了抗BLy S抗体的抗药抗体,为该药申请临床实验报批提供数据支持。