CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

ＣＳ３是某些肠毒素大肠杆菌菌体表面上的多聚物，它能使病原菌粘附于宿主的小肠上皮细胞上，是致病的重要因素．为了探索ＣＳ３菌毛抗原基因的表达调控机制，根据ＣＳ３亚基结构基因的核苷酸序列分析表明，在其翻译起始位点的上游存在着ｒｂｓ位点及原核启动子的－１０区和－３５区ＤＮＡ序列．采用基因重组技术将ＣＳ３结构基因上游１２０ｂｐ的ＤＮＡ片段亚克隆进缺乏启动子而只含报告基因ｌａｃＺ的质粒ｐＣＢ２６７中．凝胶滞留和启动报告基因表达的实验证明了ＣＳ３亚基结构基因具有自身的启动子（Ｐｓ）．将该启动子上游区域不同长度的核苷酸片段克隆进ｐＣＢ２６７中，报告基因表达结果表明ＣＳ３结构基因的表达受其上游区域的抑制．核苷酸序列分析发现，在Ｐｓ－３５区上游５５０ｂｐ和８４０ｂｐ处各存在一个富Ａ－Ｔ簇．结合原核启动子的一般作用规律推知，ＣＳ３的表达可能受ＤＮＡ结合蛋白型的正向调节因子的作用．用ＣＦＡ／１菌毛抗原基因的正向调节基因ｃｆａＤ对ＣＳ３基因进行的互补表达试验表明ｃｆａＤ基因不仅可消除上游区对Ｐｓ的抑制，而且可大幅度地提高Ｐｓ的启动能力．在分析表达调控的基础上获得ＣＳ３重组高效表达．同时提出了其表达调控模型．

CS3抗原基因的表达及纤毛装配元件的研究

在肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的已知定居因子中，ＣＳ３是临床分离株中最常见的抗原之一。为了研究ＣＳ３纤毛装配的基本元件，绘制了ＣＳ３亚基结构基因和辅助蛋白编码区的限制酶谱。通过亚克隆的亚基基因和不同辅助蛋白基因之间的互补性表达结果，确定了ＣＳ３纤毛装配所需要的辅助蛋白的ＤＮＡ功能片段。微细胞分析结果显示，ＣＳ３基因的有效表达和纤毛的装配至少需要６条蛋白多肽分子量分别为１５ｋＤａ，１７ｋＤａ，２４ｋＤａ，２７ｋＤａ，４８ｋＤａ和９０ｋＤａ。除了１５／１７ｋＤａ的蛋白多肽为ＣＳ３亚基外，其余的蛋白多肽参与ＣＳ３亚基的转运及纤毛的装配。根据以上结果初步确定了上述相关基因的相对位置。

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

定居因子抗原(CFA)是肠毒素大肠杆菌(ETEC)的重要毒性因子和保护性抗原,大多以菌毛的形式存在。此类抗原的表达及菌毛的装配需要2类基因的共同作用,即亚基结构基因和辅助蛋白结构基因。亚基是纤毛抗原的基本组成单位,而辅助蛋白则参与亚基蛋白分子的输送及装配过程。CS3亚基结构基因位于辅助蛋白结构基因的下游,处于CS3操纵子的3′端。CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析揭示。

表达CS3菌毛和CT-B抗原双价疫苗候选株的构建

人源肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起婴幼儿及旅游者腹泻的主要病原菌。ETEC的致病因子包括定居因子抗原和肠毒素。定居因子抗原多以菌毛的形式存在于细菌表面,是致病的先决条件;肠毒素则是致病的直接原因。理想的ETEC腹泻菌苗应具有定居因子抗原和肠毒素类毒素抗原,以便免疫接种后,使宿主既产生抗病原菌定居宿主肠道的抗定居因子抗体,又能产生中和肠毒素的抗肠毒素抗体。

CS3表面抗原基因的表达和纤毛装配元件的研究

在肠毒素大肠杆菌(ETEC)的已知定居因子抗原(colonization factor antigen,CFA)中,CFA Ⅰ、CFA Ⅱ和CFA Ⅳ分布较广,是优势血清型。在上述的CFAs中,CFA Ⅰ为单一抗原组分,而CFA Ⅱ则有3种抗原组分,分别称为CS1、CS2和CS3。临床分离株中常以CS1/CS3、CS2/CS3或单独以CS3的形式出现,可见CS3是CFA Ⅱ阳性菌株的共同抗原成分。已知CS3是由分子质量60Mu的质粒编码的。

CS3菌毛可以作为异源抗原决定簇的嵌合表达载体

CS3是肠毒素源性大肠杆菌的菌毛蛋白,是一种很强的免疫原。研究了利用CS3菌毛作为异源抗原决定簇载体的可能性。在计算机分析预测CS3亚基的抗原表位区、二级结构的基础上,运用PCR定点突变在CS3亚基结构基因中引入了SacⅡ酶切位点序列,插入编码霍乱毒素B亚基抗原表位CTP3的DNA序列,构建了表达CS3/CTP3的重组菌株。电镜和免疫电镜观察证明,CS3/CTP3以杂合菌毛的形式存在于菌体表面,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了CS3/CTP3杂合蛋白的存在。口服和腹腔注射免疫Bal b/c小鼠,该重组菌株可诱发抗CS3和抗CTP3的双重免疫应答。结果表明CS3可以作为表达异源抗原决定簇的表达载体,可望成为研制口服粘膜免疫多价疫苗的新型系统。

CS3抗原基因的表达及纤毛装配元件的研究

在肠毒素大肠杆菌(ETEC)的已知定居因子中,CS3是临床分离株中最常见的抗原之一。为了研究CS3纤毛装配的基本元件,绘制了CS3亚基结构基因和辅助蛋白编码区的限制酶谱。通过亚克隆的亚基基因和不同辅助蛋白基因之间的互补性表达结果,确定了CS3纤毛装配所需要的辅助蛋白的DNA功能片段。微细胞分析结果显示,CS3基因的有效表达和纤毛装配至少需要6条蛋白多肽,分子量分别为(×10~3)15、17、24、27、48和90。除了15×10~3/17×10~3的蛋白多肽为CS3亚基外,其余的蛋白多肽参与CS3亚基的转运及纤毛的装配。根据以上结果初步确定了上述相关基因的相对位置。

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核启动子的—10区和—35区DNA序列。凝胶阻滞和启动报告基因表达的实验确证了CS3亚基结构基因具有自身的启动子(Ps),怛它的作用受其上游区域的抑制。核苷酸序列分析发现,在Ps—35区上游550bp和840bp处各存在一个富A-T簇。结合原核启动子的一般作用规律推知,CS3的表达可能受DNA结合蛋白型的正向调节因子的作用,互补实验结果表明cfaD基因不仅可消除上游区对Ps的抑制,而且可大幅度地提高Ps的启动能力。在分析表达调控的基础上获得CS3重组高效表达。同时提出了其表达调控模型。

表达CS3菌毛和CT-B抗原双价疫苗候选株的构建

肠毒素性大扬杆菌(ETEC)是幼儿腹泻和旅游者腹泻的重要致病菌。理想的ETEC腹泻菌苗应具有抗菌和中和毒素的能力。本研究以Bluescript质粒为载体构建了表达CS3和CT-B的双价重组抗原的克隆株。口服免疫接种Bal b/c小鼠和肌肉注射免疫家兔,该重组菌株可以诱发抗CT-B和抗CS3的双重免疫应答,为构建多价腹泻疫苗株奠定了基础。

聚合酶链反应检测患儿尿标本中的巨细胞病毒DNA

本文建立了聚合酶链反应(PCR)检测人巨细胞病毒(HCMV)方法,探讨了该方法的某些实验条件。用PCR检测24例临床患儿尿标本。证明PCR方法特异、敏感、简便而快速。同科不同属病毒如HSV、EBV等以及人源正常细胞均无假阳性结果:最小检出量可达0.1fg DNA,相当于6个基因拷贝;用水浴箱手控时间即可进行PCR循环,30次循环仅需97min30s;PCR和DNA杂交检测尿标本中HCMV阳性例数分别为20和14例。该结果证明HCMV感染儿童的广泛性和严重性,初步表明儿童肾病综合症与HCMV有关。

应用斑点ELISA检测产肠毒素性大肠杆菌定居因子抗原

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)在发展中国家是引起婴幼儿和旅游者腹泻的最主要病原菌。据WHO预测,全世界每年因ETEC引起腹泻而致死的5岁以下婴幼儿多达80万。该菌的致病机制是,它能粘附并定居到宿主小肠表皮细胞,繁殖产生耐热肠毒素或不耐热肠毒素,前者主要由定居因子抗原(CFA)负责,

婴儿肝炎和肾病综合征患儿尿标本中巨细胞病毒DNA的检出

建立了聚合酶链反应(PCR)检测人巨细胞病毒(HCMV)DNA的方法,证明其高度特异性和敏感性。HCMV-AD_(169)株DNA的E_(co)R_1酶切J片段最小检出量为0.1fg,相当于6个基因拷贝,比地高辛标记探针的DNA杂交试验的敏感度(1pg)高10 000倍。用PCR技术检测了63份婴儿肝炎患儿和41份肾病性综合征患儿尿标本和部分肝穿刺标本,HCMV-DNA的高阳性率检出结果表明,HCMV是引起婴儿肝炎的重要病原。肾病性综合征的病因可能也与HCMV感染有关。

抑瘤素McDNA的克隆及表达研究

抑瘤素M（onecostatinM，OSM）是一种多功能的细胞生长调节因子．从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA，采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的cDNA；将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pUC19中，筛选三个阳性克隆进行序列分析，与国外报导序列完全一致；将抑癌素M的cDNA克隆到质粒pBV220后再转化DH5a进行模拟表达，SDS-PAGE分析表明有OSM表达，表达量约占细菌总蛋白5％，经过初步纯化的OSM能明显抑制A375细胞的生长．

血沉标本中人巨细胞病毒DNA的检出

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和地高辛标记探针（ｄｉｇ－ｐｒｏｂｅ）检测临床血沉标本中人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ。结果表明，人群血标本中ＨＣＭＶ－ＤＮＡ携带率较高；ＰＣＲ技术较ｄｉｇ－ｐｒｏｂｅ更敏感、快速、简便，二者检出ＨＣＭＶ－ＤＮＡ阳性率分别为８３．３％和６０．３％；ＨＣＭＶ－ＤＮＡ检出率、ＨＣＭＶ－ＩｇＭ检出率与血沉值高低之间无相关性。

染色体整合系统在多价疫苗构建中的应用研究

通过同源重组将编码异源抗原的DNA整合到减毒的鼠伤寒沙门氏菌的染色体上，获得了表达霍乱毒素B亚单位（CTB）的双价活疫苗候选株。该系统包括两个步骤：首先将GisOG缺失突变的DNA片段整合进鼠伤寒沙门氏菌疫苗候选株SL3261的染色体上，得到His营养缺陷型。然后，用带有CTB抗原基因的完整HisOGDNA片段置换HisOG缺失的DNA片段，获得表达CTB的His回复的SL3261菌株（命名为TT201）。Southern杂交证明，TT201菌株的染色体带有CTB抗原基因。Westernblot分析表明，TT201菌株能表达CTB，且具有很好的稳定性。用重组菌株口服免疫接种小鼠，能够激发抗CTB抗体的产生。TT201菌株是一种潜在的双价疫苗候选株。

四川省近60年夏季夜雨时空变化特征

为更有效地对四川省近60 a夏季夜雨的时空变化特征进行分析与研究,利用四川省126个气象台站1961-2019年的逐日降水数据资料,采用线性趋势估计法、Mann-Kendall突变检验、Morlet小波分析法和旋转经验正交函数分解(REOF)等方法,分析四川省夏季夜雨的时空变化特征。结果表明:四川省夏季夜雨量的空间分布为东多西少、南多北少型,四川省大部地区夜雨率占50%以上,最高的川南和雅安等地夜雨率可达70%以上,夏季夜雨量整体呈下降趋势,空间分布为西增东减,夜雨相对变率大值中心出现在川东北部,其相对变率数值在2倍以上,最高值中心的阆中、剑阁和旺苍3地可达到6倍。四川省夏季夜雨量REOF分析表明可以分为川西高原区(Ⅰ区)、川西南山地区(Ⅱ区)、川西北区(Ⅲ区)、川东南区(Ⅳ区)和川东北区(Ⅴ区)。四川省夏季夜雨量长期变化趋势显著,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ区夏季夜雨量呈现明显上升趋势,Ⅲ、Ⅳ区夏季夜雨量则出现下降趋势。上述各区域夜雨量突变的时间点主要发生在1970年代附近,四川省夏季夜雨量变化周期特征为长周期内包含有短周期并存在周期性的振荡,且在5个区域内夏季夜雨的变化周期以20~30 a及5~10 a的周期最普遍。

抑瘤素M cDNA的克隆及表达

抑瘤素M(Oncostatin M,OSM)是一种多功能的细胞生长调节因子。从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的cDNA;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pUC19中,筛选3个阳性克隆进行序列分析,与国外报道序列完全一致;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pBV220后再转化大肠杆菌DH5α进行模拟表达,SDS-PAGB分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白的5％;经过初步纯化的OSM能明显抑制A375细胞的生长。

人巨细胞病毒PCR检测技术的建立及应用研究

本研究在国内率先建立了检测人巨细胞病毒(HCMV)的PCR技术,并用于基础与临床,为HCMV的研究和诊断提供了先进的手段与工具。本研究HCMV—PCR的特异性和敏感性均达到国际先进水平(0.1fg)。应用HCMV—PCR探讨了临床上许多新课题:(1)血液中HCMV—DNA的检出与分析。

根据儿童心理特点探讨留守儿童心理健康发展可能性

随着我国经济的发展,城市化和工业化进程的加快,留守儿童现象也越来越普遍。笔者通过心理测量和实地调查的办法,对我国农村留守儿童心理健康状况进行研究。本文从实证主义角度出发,对比儿童心理特点,对留守儿童心理健康发展可能性作一粗略探析。

浅析我国的无效婚姻制度

我国的无效婚姻制度是婚姻家庭制度的重要组成部分，它填补了我国婚姻法的一项空白，使司法机关在处理违法婚姻时有了法律依据。本文简要介绍了我国无效婚姻制度的法定情形和无效婚姻的法律后果。