富硒酵母植物甾醇酯软胶囊辅助降血脂功能研究

为研究富硒酵母植物甾醇酯软胶囊辅助降血脂的效果,开展人体试食试验。本研究有效受试者104例,试食组58例,对照组56例。试食组每日服用富硒酵母植物甾醇酯软胶囊,对照组服用安慰剂。连续服用60天,检测相关指标。试食组前后比较,血清总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白胆固醇有显著性差异(P<0.05),而高密度脂蛋白胆固醇无显著性差异(P>0.05)。试验后,两组受试者甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇组间比较,均有显著性差异(P<0.05),而高密度脂蛋白胆固醇组间比较无显善性差异(P>0.05)。试验期间未见与受试品或安慰剂有关的不良反应,并且受试者的安全性检查指标均未见明显变化或异常现象。根据辅助降血脂功能评价方法判定标准,认为富硒酵母植物醇酯软胶囊具有辅助降血脂功能。

再生丝素蛋白纳米纤维网支持和引导神经胶质细胞的生长与迁移

除了自体和异体移植外,利用生物相容性材料辅助中枢神经系统损伤后的修复成为最具开发潜力的方法之一。以来源于家蚕和柞蚕的再生丝素蛋白纳米纤维网作为星形胶质细胞的生长基质,研究星形胶质细胞在其上的粘附、生长、增殖和迁移等生命活动。结果显示星形胶质细胞在两种材料上表现出很高的相容性,星形胶质细胞在丝素蛋白纳米纤维网上具有正常的粘附、增殖和迁移等行为。更重要的是,通过实时显微摄像跟踪细胞的生长与迁移行为,发现星形胶质细胞的生长与迁移表现出很强的丝素蛋白纳米纤维依赖性,星形胶质细胞在丝素纤维上生长铺展并且沿着纤维进行迁移,纤维的走向决定着细胞的迁移轨迹。实验证明,丝素蛋白纳米纤维不仅能够支持星形胶质细胞的生长,而且对星形胶质细胞的迁移运动还有引导作用,这些特点使得再生丝素蛋白纳米纤维网成为极具开发潜力的神经组织工程替代物。

定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质

基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A^(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly^(320)的密码子GGT突变为Asp^(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A^(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A^(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A^(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A^(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A^(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly^(320)突变为Asp^(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。

置换β-甘露聚糖酶底物结合槽内环结构序列改善其酶学特性

位于酶分子活性位点（又称活性中心）附近的环结构对酶促反应特性具有重要影响.本实验室先前在宇佐美曲霉Aspergillus usamii中发现了一种新的5家族β-甘露聚糖酶Au Man5A.通过同源建模、分子对接及多序列比对,发现位于Au Man5A底物结合凹槽侧壁的一段环结构可能对酶的功能有影响.为证明该假说,本研究采用Au Man5A为母本,利用PCR技术将其底物结合槽内的7肽环结构316KSPDGGN322替换成与两种木霉属β-甘露聚糖酶对应的8肽片段AQSNSDPY,构建了杂合酶基因Auman5ALoop,并在毕赤酵母GS115中进行表达,经纯化获得了杂合β-甘露聚糖酶Au Man5ALoop.酶学特性分析结果显示,与原酶Au Man5A比较,Au Man5ALoop的最适反应p H由3.5~4.0扩宽至3.5~5.5;最适反应温度由65℃提高至70℃;以角豆胶为底物,测得Au Man5ALoop的比活性由351.2 U/mg提高至2 089.2 U/mg.利用双倒数作图法测得动力学常数揭示,Au Man5ALoop的Km值较Au Man5A降低了36%,而kcat值是Au Man5A的6.8倍;同时,Au Man5ALoop的催化效率（kcat/Km）提高了10.7倍.我们的结果说明,通过替换Au Man5A底物结合槽内环结构,可明显改进其酶学特性.我们的结果还提示,活性位点附近的环结构对β-甘露聚糖酶的酶学特性具有重要影响.

耐热β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达及酶学性质

基于生物信息学和基因组学分析的结果,采用RT-PCR技术从宇佐美曲霉（AspergiLLus usamii）E001中克隆出一种糖苷水解酶（GH） 26家族β-甘露聚糖酶（AuMan26A）成熟肽编码基因（A uman26A）,成功实现其在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的异源表达.重组β-甘露聚糖酶（reAuMan26A）的发酵上清液对角豆胶的酶活性为281.9 U/mL,纯化后比酶活为2281.7 U/mg.其最造反应温度Topt为40℃;在80℃处理60 min后残留酶活性为60％;90℃时的半衰期T1/290为10 min,处理60 min后残留酶活性仍为33％;其最适pH为5.5,在pH 5.0～7.0的范围内较稳定;Fe^2＋和Fe^3＋对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;所测酶的最适底物为角豆胶,其次是魔芋粉和瓜尔豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为15.25 mg/mL和7 841.9 U/mg.reAuMan26A良好的热稳定性使其在食品、饲料和纺织等工业具有广阔的应用前景.

重组β-甘露聚糖酶制备低聚葡甘露糖工艺条件的优化

研究了利用自主构建的重组毕赤酵母菌株GS115/Auman26A所产β-甘露聚糖酶水解魔芋粉制备低聚葡甘露糖的工艺条件。以底物魔芋粉的水解率为指标,通过单因素试验确定酶法制备低聚葡甘露糖的酶解条件如下:加酶量60 U/g,酶解温度40℃,魔芋粉质量浓度30 g/L,酶解时间5 h。魔芋粉水解率和酶解液还原糖质量浓度分别为53.3%和10.45 mg/m L。超滤后的酶解产物经高效液相色谱检测可知组分主要以低聚葡甘露糖为主,其中还原性单糖占9.83%,二糖以上的低聚葡甘露糖占90.17%。

不同类型连接肽对β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响

以柔性肽F(GGGGS)3或刚性肽R(EAAAK)3为连接肽,将海栖热胞菌27家族碳水化合物结合域(CBM27)与宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)的C末端融合,探讨不同类型连接肽对Au Man5A酶学性质的影响,获取具有优良酶学性质的融合酶。采用重叠PCR技术扩增融合酶基因Auman5A-F-cbm^27和Auman5A-R-cbm^27,分别将Auman5A和融合酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物reAuMan5A、reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C的酶学性质。结果表明:该3种β-甘露聚糖酶对角豆胶的K_m值分别为1.7、1.9和0.9 mg/mL。3种酶的最适温度T_(opt)分别为70、65和70℃;reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)分别为36 min和124 min,较reAuMan5A的(t_(1/2)^(70)=9 min)延长了3倍和12.8倍。reAuMan5A-R-C具有底物亲和力强、热稳定性高和pH稳定范围广等特点,在食品、饲料、医药和能源等领域有着巨大的应用潜力。

融合β-甘露聚糖酶基因的构建、表达及酶学性质的分析

宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)是一种仅含催化域(CM)的单结构蛋白。为改善其酶学性质,基于理性设计将海栖热胞菌(Thermotoga maritima)MSB8的27家族碳水化合物结合域(CBM27)融合至Au Man5A的C-端,并采用重叠PCR技术构建融合酶基因Auman5A-cbm27。分别将Auman5A-cbm27和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,对重组表达产物re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A进行纯化和酶学性质测定。结果表明,re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A的最适温度均为68℃;两者分别在68和60℃及以下稳定。同时,前者较后者具有更广泛的p H稳定范围。re Au Man5ACBM27对角豆胶的Km值由融合前的1.7 mg/m L降至0.7 mg/m L,表明Au Man5A的底物亲和力得到了提高。

无血清培养条件下神经元前体细胞的增殖

目的:建立新生大鼠大脑皮层细胞原代培养体系并进行神经元前体细胞的增殖研究。方法:原代混合培养新生大鼠大脑皮层细胞;混合培养体系用血清培养基培养6d后换用无血清培养基培养,免疫细胞化学显色鉴定此培养过程中不同时间点的细胞类型,并在不同时间段加入BrdU,用于分析神经元前体细胞的增殖状况。结果:换用无血清培养基培养后,出现明显的细胞分层现象;神经元及其前体细胞的比例逐渐上升,而神经干细胞和星形胶质细胞的比例缓慢下降;增殖细胞的比例在0～24h、24～48h、48～72h时间段里逐渐增加,而在72～96h、96～120h时间段里逐渐减少。结论:新生大鼠大脑皮层细胞混合培养体系在无血清培养条件下促进神经元前体细胞的增殖。

大鼠大脑皮层细胞条件培养液促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究

目的建立大脑皮层细胞条件培养液促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的方法。方法原代培养并鉴定骨髓间充质干细胞;用条件培养基、无血清培养基、DMEM分别诱导骨髓间充质干细胞6h和24h;用免疫荧光染色的方法鉴定由骨髓间充质干细胞分化而来的神经样细胞。结果骨髓间充质干细胞表达CD106、CD90、CD29和CD44标记物,不表达CD71、CD45和CD34,回收得到的条件培养基可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,这些神经样细胞的免疫荧光染色呈β微管蛋白Ⅲ、胶质原纤维酸性蛋白、巢蛋白阳性,且阳性比例明显高于实验对照组,差异有高度统计学意义(P<0.001)。结论大脑皮层细胞条件培养液能促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化。

脂肪酶热稳定性改造研究进展

热稳定性改造是脂肪酶酶学性质研究的热点之一,随着技术的发展,越来越多的有效手段被用于脂肪酶热稳定性改造。作者综述了影响脂肪酶热稳定性的主要因素、提高其热稳定性的研究方法以及最新研究成果,为脂肪酶的进一步改造提供依据,并对其他酶的酶学性质改造具有借鉴意义。

富硒酵母对长期缺硒和正常大鼠体内D-丝氨酸和L-丝氨酸水平的影响

本试验在建立缺硒大鼠模型的基础上,研究饲粮补充富硒酵母对长期缺硒和正常大鼠体内D-丝氨酸与L-丝氨酸水平的影响。将3周龄Sprague-Dawley大鼠随机分为缺硒组和正常组,分别饲喂低硒饲粮(含硒0.02 mg/kg)和正常饲粮(含硒0.18 mg/kg),饲喂期为420 d。第421天,将缺硒组大鼠分为4组:缺硒空白对照组(SD-B组,n=17)、缺硒富硒酵母低剂量组(SD-LY组,n=16)、缺硒富硒酵母中剂量组(SD-MY组,n=20)、缺硒富硒酵母高剂量组(SD-HY组,n=16)。将正常组大鼠分为2组:正常空白对照组(SS-B组,n=20)、正常富硒酵母中剂量组(SS-MY组,n=20)。SD-B组继续饲喂低硒饲粮,SD-LY、SD-MY、SD-HY组分别饲喂含0.18、0.36和0.72 mg/kg硒的富硒酵母饲粮,SS-B组继续饲喂正常饲粮,SS-MY组饲喂含0.36 mg/kg硒的富硒酵母饲粮,饲喂期为112 d。结果显示:1)缺硒60 d后,缺硒组大鼠体重显著低于正常组大鼠(P<0.05)。2)补硒112 d后,与SD-B组相比,SD-LY、SD-MY、SD-HY、SS-B、SS-MY组血浆硒水平显著升高(P<0.05);SD-LY、SD-MY、SD-HY、SS-MY组大脑皮质硒水平显著升高(P<0.05);SD-MY、SD-HY、SS-MY组小脑硒水平显著升高(P<0.05)。与SS-B组相比,SS-MY组小脑和大脑皮质硒水平显著升高(P<0.05),血浆硒水平无显著变化(P>0.05)。3)补硒112 d后,与SD-B组相比,SD-LY、SD-MY、SD-HY、SS-B和SS-MY组血浆L-丝氨酸水平显著降低(P<0.05),D-丝氨酸水平无显著变化(P>0.05);SD-LY组大脑皮质L-丝氨酸水平显著降低(P<0.05),SD-LY、SD-MY、SD-HY、SS-B和SS-MY组大脑皮质D-丝氨酸水平无显著变化(P>0.05);SD-HY组海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平极显著升高(P<0.01),SD-LY、SD-MY、SS-B和SS-MY组海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平无显著变化(P<0.05)。与SS-B组相比,SS-MY组血浆、大脑皮质和海马L-丝氨酸、D-丝氨酸水平无显著变化(P>0.05)。由此得出,饲粮补充富硒酵母显著升高大鼠长期缺硒引起的血浆硒水平下降,增加大脑皮质与小脑硒水平,降低血浆L-丝氨酸水平,升高海马L-丝氨酸与D-丝氨酸水平。此外,饲粮补充富硒酵母还可显著升高正常大鼠大脑皮质与小脑硒水平。

布拉氏酵母对抗生素相关腹泻作用的研究进展

抗生素相关腹泻(Antibiotic-associated diarrhea, AAD)是抗生素应用的重要并发症。除开抗生素本身对胃肠道的刺激外,AAD发生的主要原因是抗生素使用后引起的肠道菌群失调,造成肠道代谢功能紊乱和致病菌如艰难梭菌的感染。益生菌作为经口服摄入的活体微生物,能帮助肠道恢复正常的菌群结构,从而预防和治疗AAD。多种益生菌已被应用于临床研究,其中布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)作为不同于其它酵母菌株和细菌的真菌类益生菌,在胃肠道适应性、安全性上有独特的优势。实验研究表明,布拉氏酵母在防治AAD中具有多种生理活性。多个随机对照试验将布拉氏酵母应用于防治AAD,系统性综述结果表明布拉氏酵母是防治AAD的强烈推荐菌。

叶黄素软胶囊缓解视疲劳功能研究

目的:研究以蓝莓提取物、叶黄素酯和天然β-胡萝卜素为主要原料制得的叶黄素软胶囊缓解视疲劳的功效。方法:选取106例受试者,按随机双盲法分为试验组和对照组,以症状总积分、总有效率、明视持久度等为功效评价指标,血、尿常规检查,肝、肾功能及血糖检查,腹部B超,心电图等为安全评价指标,研究叶黄素软胶囊缓解视疲劳的功效和安全性。结果:试验组试食前后比较,症状总积分、明视持久度有显著差异(P<0.01),平均明视持久度提高11.32%,左、右眼视力无显著差异(P>0.05)。试验后两组间比较,症状总积分、症状改善有效率、左眼视力改善有效率有显著差异(P<0.05),明视持久度有显著差异(P<0.01),平均明视持久度提高13.46%。对照组和试验组试验前后未见不良反应,各项安全性指标均未见异常。结论:叶黄素软胶囊对人体具有缓解视疲劳功能且对肌体健康无不良影响。

Rac1蛋白表达与神经前体细胞增殖分化的关系

目的探讨Rac1蛋白表达与神经前体细胞增殖分化的关系。方法取新生大鼠大脑皮层,原代培养获得混合细胞培养体系,在含10%血清的培养基中培养6 d细胞汇合后更换无血清培养基继续培养。实验中设计4个时间点,用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化的变化,免疫荧光染色技术鉴定细胞种类以及Rac1蛋白在细胞内的表达,通过Western blot检测Rac1蛋白的表达变化。结果建立了新生SD大鼠大脑皮层原代混合细胞培养体系,此体系底层主要是由Ⅰ型胶质细胞组成的单层细胞,GFAP染色呈阳性;在单层细胞上面有一些小圆形强折光性神经前体细胞生长,βⅢ-Tubulin染色呈阳性。更换无血清培养基后上层神经前体细胞大量增殖,βⅢ-Tubulin、Rac1染色呈阳性。Western blot定量分析结果显示,神经前体细胞增殖过程中Rac1蛋白表达上升,而分化过程中Rac1蛋白的表达下降。结论Rac1蛋白表达与神经前体细胞的增殖分化过程密切相关,可能参与了神经前体细胞的增殖分化过程。

β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp^(320)的相关性分析

【目的】为改善宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)的酶学性质,本实验室前期将AuMan5A底物结合凹槽内一个7肽(^(316)KSPDGGN^(322))组成的loop替换为烟曲霉5家族β-甘露聚糖酶对应的氨基酸片段(PSPNDHF),得到loop替换突变酶AuMan5A/Af。为揭示AuMan5A/Af酶学性质显著改善与其Asp^(320)的相关性,定点突变构建突变体AuMan5A/Af^(D320G)。【方法】采用大引物PCR技术将AuMan5A/Af基因(Auman5A/Af)中编码Asp^(320)的密码子GAC突变为Gly^(320)的GGT,构建出突变体基因Auman5A/Af^(D320G),并在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物AuMan5A/Af^(D320G)的酶学性质。【结果】AuMan5A/Af^(D320G)的最适温度T_(opt)为70.0℃,变性温度T_m为71.5℃,介于AuMan5A(T_(opt)=65.0℃,T_m=64.5℃)和AuMan5A/Af(T_(opt)=75.0℃,T_m=76.6℃)之间;在70.0℃的半衰期为40 min,高于AuMan5A的10 min,但较AuMan5A/Af的480 min显著缩短;比活性分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的2.7和0.3倍;催化效率(k_(cat)/K_m)分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的3.9和0.3倍。【结论】将Asp^(320)突变为Gly^(320)显著影响了AuMan5A/Af的酶学性质,证明了Asp^(320)对AuMan5A/Af温度特性改善、比活性和催化效率显著提高的重要作用。

神经元在丝素蛋白材料上的生长发育

目的研究神经元在丝素蛋白材料上的生长发育,为神经干细胞结合丝素蛋白材料用于临床移植修复神经系统损伤提供实验依据。方法从新生大鼠脑室下区(SVZ)分离细胞,培养在柞蚕、家蚕两种丝素蛋白溶液制成的薄膜材料上,分别选取各时间段的细胞进行β-Ⅲ-tubulin特异性免疫荧光染色,并统计不同时间段神经元在丝素材料上的成活率及复杂度。结果神经元在柞蚕丝素薄膜上的成活率和复杂度明显比家蚕丝素薄膜高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论柞蚕、家蚕丝素薄膜支持神经元的生长,具有良好的生物相容性;柞蚕丝素薄膜比家蚕丝素薄膜更适合神经元的生长。

杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A^(loop)的H321对其酶学性质的影响

目的:将loop置换杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A^(loop)的H321突变回野生型酶AuMan5A对应的Gly,以分析杂合酶的酶学性质与H321的相关性。方法:采用大引物PCR技术将AuMan5A^(loop)基因(Auman5Aloop)编码H321的密码子CAC突变为Gly的GGT,构建突变酶基因Auman5A^(loop/H321G);借助表达质粒pPICZαA将该突变酶基因在Pichia pastoris GS115中实施表达,并分析重组表达产物AuMan5A^(loop) H321G的酶学性质。结果:AuMan5A^(loop/H321G)置换前后的最适温度T_(opt)均为75℃,高于AuMan5A的65℃;AuMan5A^(loop/H321G)在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)为300 min,介于AuMan5A(10 min)和AuMan5A^(loop)(480 min)之间;AuMan5A^(loop/H321G)比活性分别为AuMan5A和AuMan5A^(loop)的12.8和1.43倍;催化效率k_(cat)/K_m为后两者的14.1和1.12倍。结论:通过H321G置换及对3种酶的温度特性、比活性和催化效率的测定及比较,证实了H321对AuMan5A^(loop)的酶学性质有一定的影响。

4种蛋白质粉末原料的气味稳定性对比研究

为对比大豆分离蛋白、浓缩乳清蛋白、食用酵母粉和酵母蛋白的气味稳定性,将4种蛋白质粉末原料分别与钙、锌和铁化合物的混合物进行复配,用感官分析以顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术研究样品在加速试验过程中的气味变化。感官分析结果表明,与矿物质复配后的大豆分离蛋白和浓缩乳清蛋白原料样品,加速试验过程中都出现显著的气味变化;与独立样品相比,气味变化加快且哈败气味更浓。食用酵母粉和酵母蛋白并未出现明显的气味变化。仪器分析结果表明,以己醛为代表的醛类物质等挥发性成分变多是大豆分离蛋白和浓缩乳清蛋白气味变化的主要原因,主要来自于蛋白原料中残留不饱和脂肪酸的氧化裂解,而矿物质化合物中的金属离子对挥发性成分的释放有明显的催化加速作用。食用酵母粉和酵母蛋白可能由于本身气味成分简单,以及细胞壁对油脂的包裹作用,较少被矿物质化合物影响,在加速试验中的气味变化不明显。

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。