NLRC4炎症小体介导自噬反应在脓毒症心肌功能障碍小鼠中的作用

背景:研究发现炎症小体及自噬在脓毒症患者的免疫功能中扮演了重要角色。但现阶段研究仅局限于探索脓毒症中某一自噬信号通路的变化特点,对脓毒症心肌功能障碍自噬调控的具体机制尚未阐明。目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白4(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing protein 4,NLRC4)炎症小体与自噬水平在小鼠脓毒症心肌功能障碍中的变化,以期为脓毒症心肌功能障碍的发生机制提供理论依据。方法:昆明雄性小鼠48只,随机分为6组,分别为假手术(6,12,24 h)组和盲肠结扎穿孔(6,12,24 h)组。盲肠结扎穿孔组结扎小鼠盲肠远端1/2,22号针头来回穿刺2次,挤出少许肠内容物;假手术组不结扎穿孔,其余操作与盲肠结扎穿孔术相同。观察小鼠术后一般情况,超声测定小鼠心功能,ELISA法检测肿瘤坏死因子α、肌钙蛋白T质量浓度;苏木精-伊红染色法观察心肌病理变化;透射电镜观察心肌线粒体及自噬体变化;实时荧光定量PCR检测心肌组织NLRC4 mRNA的表达,Western blot检测心肌组织炎症因子、LC3、Beclin-1、NLRC4的蛋白表达。结果与结论:(1)小鼠盲肠结扎穿孔术后6 h肿瘤坏死因子α、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.05);术后12 h,肿瘤坏死因子α、肌钙蛋白T质量浓度升高,左室射血分数及左室短轴缩短率降低,NLRC4 mRNA及蛋白、白细胞介素1β、白细胞介素18、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均升高(P<0.05);术后24 h,NLRC4 mRNA及蛋白表达进行性升高,白细胞介素1β、白细胞介素18维持高表达,Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P<0.05);(2)心肌病理学改变(苏木精-伊红染色):假手术组及盲肠结扎穿孔术后6h组,心肌纤维正常,未见炎症细胞浸润;盲肠结扎穿孔术后12 h,心肌纤维水肿,炎症细胞浸润;随着时间的延长,心肌纤维排列紊乱,炎症细胞浸润加重,部分心肌纤维出现变性坏死;(3)透射电镜显示:盲肠结扎穿孔组心肌线粒体肿胀,随着时间的延长,线绿体肿胀加重,出现线粒体空泡变性,肌原纤维有轻度溶解;盲肠结扎穿孔术后6 h出现自噬小体,12 h自噬小体数目增多,24 h偶见自噬小体;(4)提示盲肠结扎穿孔术后12 h,小鼠脓毒症心肌功能障碍模型建立成功;在脓毒症心肌功能障碍中,NLRC4炎症小体的过度激活通过下调自噬水平表达,参与了脓毒症心肌功能障碍的发病。

脓毒症心肌功能障碍关键基因的筛选及生物信息学分析

目的筛选脓毒症心肌功能障碍(SIMD)的关键基因,分析其主要参与的生物学过程。方法利用R软件对脓毒症患者及SIMD小鼠模型的数据集进行差异分析,提取SIMD相关基因,并进行生物学分析、相关性分析及蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。结果脓毒症小鼠模型、脓毒症患者分别有143个和318个差异基因,其中包含84个SIMD基因,下调基因54个,上调基因30个。脓毒症及SIMD差异基因在基因本体和京都基因和基因组数据库富集分析中具有相似的生物学功能。ANXA3、S100A8、LCN2、LTF、KLHL2等为SIMD的关键基因;LTF、LCN2、SOCS3等为SIMD的关键蛋白。结论LCN2、LTF、ANXA3、S100A8、KLHL2、SOCS3等多个关键基因可能参与SIMD的病理生理过程,对SIMD的临床诊断、预后判断及治疗有进一步研究意义。

抑制Rictor对脓毒症小鼠心肌自噬水平的影响

目的研究抑制Rictor对脓毒症小鼠心肌自噬水平的影响。方法健康雄性SPF级昆明种小鼠36只采用随机数字表法为假手术组、模型组、实验组,每组12只。利用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症动物模型,实验组给予Rictor特异性抑制剂JR-AB2-01110 mg/kg腹腔注射,假手术组及模型组给予等量生理盐水。术后12 h及24 h分别取各组6只小鼠采集腹主动脉血,检测血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平;检测小鼠心尖组织中Rictor、Akt、Raptor、LC3B表达变化;透射电镜及HE染色下观察心肌组织病理结构变化。结果模型组各时间点cTnI、CK-MB、Rictor、Phospho-Aktser473、Raptor高于假手术组(P<0.05)。实验组各时间点cTnI、CK-MB、Rictor、Phospho-Aktser473、Raptor低于模型组,LC3B高于模型组(P<0.05)。假手术组心肌组织排列正常;模型组可见心肌纤维中度水样变性;实验组可见少量心肌纤维水样变性,细胞肿胀。透射电镜下,模型组及实验组均可观察到自噬体及自噬溶酶。结论抑制Rictor可增强脓毒症小鼠心肌细胞自噬,减轻细胞损伤。