人参SQS基因的干扰载体构建及转化人参愈伤组织

以5年生人参为材料,根据人参SQS基因设计正义及反义片段引物,构建了SQS基因干扰表达载体;利用农杆菌转化法转化人参愈伤组织,对获得的抗性愈伤组织进行PCR检测及实时定量PCR检测,并对抗性愈伤组织的皂苷进行HPLC分析.实验结果表明,与非转化人参愈伤组织相比,转化后的愈伤组织SQS基因表达量降低,皂苷含量有所变化.SQS是人参皂苷生物合成途径的关键酶,抑制SQS基因的表达,可调控人参皂苷含量变化.

aFGF植物表达载体构建及转化紫花苜蓿的初步研究

主要将aFGF基因按照植物偏爱的密码子进行基因优化,同时加上信号肽、6-组氨酸标签及凝血酶切割因子,合成全基因,再将基因插入到改造的TΩ4AB质粒中,将aFGF基因和质粒上的增强子、启动子、Ω序列及ployA加尾序列双酶切,命名为TΩ4AB-aF,将TΩ4AB-aF插入到pBI121载体中命名为pBI121-TΩ4AB-aF。利用三亲融合法将pBI121-TΩ4AB-aF转入到农杆菌菌株LBA4404中,转化苜蓿。转基因苗用卡那霉素进行筛选;并对抗性苗进行PCR、RT-PCR、Western Blot检测。结果表明,aFGF在苜蓿中得到表达。为苜蓿作为植物生物反应器奠定理论基础。

水杨酸诱导下人参培养物差异表达基因片段的克隆

本研究以人参愈伤悬浮细胞为材料,在其生长的第28天添加1×10-3mg/L水杨酸,测定水杨酸添加后,过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等3种酶在72h内的变化及皂苷含量,结果表明:水杨酸添加后对过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活力影响最大,分别在24h和48h达到最大峰值,在18h开始影响多酚氧化酶的活力,培养物生长的第28天添加水杨酸可以明显提高人参愈伤组织中皂苷的合成。确定添加水杨酸后24h提取总RNA,进行cDNA-RDA分析,筛选差异片段。确定差异基因并在GenBank中注册,注册号为FE900130。为探讨水杨酸作为诱导子对人参次生代谢的影响奠定基础。

人参皂苷生物转化及固体发酵工艺研究进展

研究表明,人参皂苷在体外可以转化成多种稀有皂苷,它们是在生物体内发挥药理活性的关键物质。微生物转化法及固体发酵技术是工业化生产稀有人参皂苷的基础。文中针对皂苷生物转化研究概况进行综述,探讨了固体发酵工艺条件,并对目前人参皂苷生物转化研究中存在的问题及今后的主要发展方向进行了展望。

2，4-D、BA对人参体细胞胚胎发生过程的影响研究

以人参芽胞、二年生人参根、实生苗(茎、叶)为外植体研究了体细胞胚的发生条件,并对其发生过程中可溶性蛋白、相关酶活性及内源激素的变化等进行了研究。结果表明,诱导愈伤组织的培养基为MS+2,4-D4.0mg/L+BA0.2mg/L;在MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.2mg/L培养基上继代培养,可获得胚性愈伤组织;在无2,4-D的培养基上可诱导出胚状体。将胚状体转入无任何激素的MS培养基上继续培养,之后转入1/2MS培养基上获得再生植株。在体细胞胚胎发生过程中,可溶性多糖和可溶性淀粉含量在早期胚时较低,可溶性蛋白含量、POD及PPO活性在早期胚时最高;IAA在早期胚时期含量最高,在成熟胚时期ABA含量最高,而ABA/IAA比值在成熟胚时较高,利于体细胞胚的发育成熟。

人参遗传多样性的SSR分析

[目的]分析吉林省5个人参产区人参(Panax ginseng C.A.Mey)种质资源存在的差异性,为参农异地引种提供理论依据。[方法]利用SSR技术对吉林省5个人参产区9个人参类型的DNA进行检测,并利用DPS9.50专业版软件进行相异系数计算,用Nei-Li公式和UPGMA法构建聚类树状图。[结果]从25对引物中筛选出16对多态性引物用于扩增,共扩增出181条条带,其中,多态性条带117条,多态性64.7%。[结论]人参种质资源在分子水平上存在较大差异;人参不同类型间的差异主要由其遗传因素决定,但也与环境因素有关。

真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影响

以黄芪愈伤组织为试验材料,研究了不同种类真菌及同种真菌的不同浓度、不同添加时间和作用时间对黄芪愈伤组织生长和皂苷含量的影响。用真菌提取物对黄芪愈伤组织进行诱导处理后,检测黄芪愈伤组织的生长量和皂苷含量以及代谢过程中POD、PAL、PPO、CAT的酶活性和NO、MDA、H2O2的含量。结果表明:80μg/mL的散子囊菌作为诱导子处理黄芪愈伤组织效果最佳,细胞的鲜重和皂苷含量分别达到12.387 g和11.508 4 mg/g,并且在培养的第28天加入,作用时间为7 d,此时皂苷的产率达1.42%。真菌诱导子的加入可以激发黄芪细胞的防御性应答反应,产生氧迸发和一氧化氮迸发,细胞的氧化还原态势发生了明显的变化,膜脂过氧化产物MDA的含量大幅度提高,POD、PPO、CAT的活力出现波动性的变化,并具有一定的时序性,同时与次生代谢产物积累有关的PAL活力也得到大幅度提高。

人参原生质体的分离培养

以人参愈伤组织细胞悬浮系为材料,研究了人参原生质体的分离纯化方法及影响因素。结果表明:以人参愈伤组织细胞悬浮系为材料,在加入1%纤维素酶和0.5%果胶酶、甘露醇浓度0.7 mol/L的酶解液中酶解8 h分离得到的人参原生质体产量最高;采用人参与胡萝卜共培养培养基,进行看护培养成功地培养出愈伤组织。

诱导子协同对黄芪愈伤组织生理生化指标的影响

[目的]利用水杨酸和真菌诱导子协同作用,研究其对黄芪细胞培养物生理生化指标的影响,为药用植物作为生物反应器生产有用的次生代谢产物提供理论基础和技术体系。[方法]以黄芪组织培养物为材料,测定黄芪愈伤组织中POD、PAL、CAT的生物活性。[结果]黄芪愈伤组织中过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶及过氧化氢酶活性高于对照;H2O2和NO含量也明显高于对照。[结论]水杨酸和真菌诱导子的共同作用提高了黄芪愈伤组织的抗性,有利于黄芪愈伤组织生长,如在生产中加入诱导子,可创造更大的商业价值。

超级稻吉粳88再生体系的建立

以超级稻吉粳88成熟胚作为外植体,通过对基本培养基、激素组合和干燥处理时间的筛选优化试验,以建立超级稻吉粳88的再生体系。结果表明,以NMB作为基本培养基,2,4-D2.0mg/L、NAA0.1mg/L、KT0.2mg/L和蔗糖40g/L组合条件下,能够诱导出质量较好的愈伤组织,诱导率在80%以上;采用滤纸干燥法对愈伤组织进行干燥处理48h,可使愈伤组织分化率和成苗率明显提高,分化率可达95.0%,成苗率可达20.4%。

RNA测序的研究进展

RNA测序研究是基因功能及结构研究的基础,能够从整体水平研究基因功能及其结构。随着高通量测序和定量检测技术的不断发展,能够通过RNA测序对转录组进行更深度更完整的研究。该研究进展包括改善转录起始位点的预测、链特异性测序、融合基因的检测、microRNA定量的分析以及RNA可变剪切的识别。目前利用单分子测序技术可以实现RNA的直接测序,通过二代测序技术与单分子测序技术相结合的方式,能更深层次、更全面地获得转录组信息。

人参植株再生体系的建立和优化

以人参种子、芽胞、茎、叶为外植体,通过器官发生途径建立人参高效再生体系。筛选出不定芽诱导的最佳培养基为MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA,继代培养基为MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA和MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L IBA,生根培养基为1/2 MS+1.0 mg/L NAA;16 h光照/8 h黑暗培养。移栽获得再生植株。

西洋参各部位皂苷成分的HPLC测定

采用索氏技术提取样品液,HPLC法测定西洋参中6种主要单体皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量。比较分析西洋参各部位总皂苷及单体皂苷的含量差异。色谱条件:Hypersil-C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),水和乙腈梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温35℃,检测波长203 nm,进样量20μl。在选定的色谱条件下,各单体皂苷在其浓度范围内线性关系较好。测定结果表明,西洋参各部位皂苷成分的含量存在一定差异。该方法分析人参皂苷成分简捷有效。适用于西洋参不同样品材料的人参皂苷含量分析。

SSR分子标记及其在植物遗传育种中的应用

分子标记技术是基于生物体基因组的遗传分析方法,在植物的亲缘关系分析、遗传多样性分析、遗传图谱构建、分子辅助育种、品种鉴定等研究中已有广泛应用。其中微卫星分子标记(Simple sequence repeats,SSRs)技术作为一种新世纪遗传学研究工具,以其信息量大,重复性好、可靠性高和多态性丰富等优点,在植物遗传育种研究中表现出很大的优势。本文简要介绍了简单重复序列(SSRs)标记的分布、功能、技术优缺点和产生多态性的机理,并对SSR标记在植物遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位与克隆、分子标记辅助育种等研究中的应用情况进行了综述,为植物资源利用、开发和保护等研究领域的应用提供参考。

人参SQS和SE酶基因的克隆及其表达载体的构建

鲨烯合酶(SQS)和鲨烯环氧酶(SE)是人参皂苷生物合成过程中的关键酶。以五年生人参叶片为供试材料提取总RNA,根据GeneBank上已发布的SQS和SE基因登录号(AB010148和AB122078),查找对应序列并设计特异性引物,运用RT-PCR方法,通过构建pMD18-T重组质粒、测序分析,成功克隆到大小分别为1440bp的SQS基因和1780bp的SE基因。同时还构建了这2个基因的表达载体pCAMBIA1301-SQS和pCAMBIA1301-SE,从而为分子水平上探讨三萜皂苷生物合成机理及其在药用植物中的应用提供试验材料。

大片段DNA克隆载体的研究进展

DNA克隆技术是分子生物学和基因工程研究中非常重要的一项技术。自第一个质粒载体pSC101作为第一个克隆载体以来,随着分子生物学技术的迅猛发展克隆载体的整体结构、容载能力和转化效率都有了很大的改善。通过综述克隆载体的发展概况,以及大片段DNA文库的构建和应用,对大片段DNA遗传转化的发展做了展望。

人参皂苷生物合成调控的研究进展

人参皂苷作为五加科人参属植物的一种次生代谢产物,因其广泛的生理药理活性,具有巨大的应用价值。本文主要介绍了人参皂苷生物合成途径及参与合成的关键酶类,并分别从细胞水平和分子水平探讨了通过添加生长素、诱导子,使用反义载体、RNA干扰技术等方法,对于人参皂苷生物合成进行调控,在阐述合成途径的基础上,为进一步调控人参皂苷的生物合成,提高产量,从而为工业化应用奠定良好的基础。

平贝母愈伤组织的诱导及植株再生

平贝母为一味传统中药,但其产量却受繁殖系数低等因素限制。因而为筛选出平贝母鳞茎再生的最佳离体培养体系,本文分别研究了外植体种类,激素的不同浓度和组合以及光照对愈伤组织诱导的影响和不定芽再生的影响。

碱性成纤维细胞生长因子在苜蓿中的表达

为了降低bFGF(basic fibroblast growth factor)的生产成本,结合植物生物反应器的优点,就bFGF在转基因苜蓿中的表达进行了探索。将bFGF插入植物表达载体pBII21中,获得了含有bFGF基因的植物表达pBIcbFGF,再将pBIcbFGF利用冻融法转到农杆菌中。利用农杆菌介导法将基因转化保定苜蓿,转基因苜蓿在TM-1培养基+20mg/L卡那霉素(Kan)+200mg/L特美汀(Tim)中诱导分化,在生根培养基中生根,获得再生植株。再生植株通过PCR检测、RT-PCR及Western blot证实外源基因已经在苜蓿中成功表达。获得含有目的蛋白的阳性植株。为苜蓿作为植物生物反应器生产bFGF奠定了理论及技术基础。

人参发状根低聚糖的单糖组成分析

目的:建立高效液相色谱法测定人参发状根低聚糖的单糖组成。方法:采用水提醇沉法对人参发状根低聚糖进行提取,以1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)为柱前衍生化试剂,采用高效液相色谱分析单糖组成,色谱条件:色谱柱为Agilent Edipse XDB-C18(200 mm×4.6 mm,5μm);流动相A为0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(p H 7.0),B为乙腈;洗脱体积A∶B=80.4∶19.6;流速1.0 m L/min;检测波长245 nm。结果:人参发状根低聚糖中甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)的摩尔比为1.00∶1.23∶4.63∶1.42∶1.15。结论:该方法测定人参发状根低聚糖的单糖组成,实验简便、稳定,结果准确、可靠。