2017-2018年山东省奶牛场犊牛腹泻相关病毒病原学检测

为了解山东省奶牛养殖场中引起犊牛腹泻相关病毒的流行情况,2017-2018年,在全省13个地区51家规模化奶牛养殖场,采集624份犊牛腹泻病料样品,进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛冠状病毒(BCo V)和牛轮状病毒(BRV)PCR检测,并对检测结果采用SPSS 20.0软件进行数据统计以及显著性差异分析(Pearson卡方检验)。结果显示:BVDV、BEV、BCo V、BRV个体检出率分别为34.58%、11.78%、8.84%、17.70%,群体检出率分别为47.83%、38.89%、35.71%、33.33%,BVDV检出率显著高于其他3种病毒(P<0.01),且有流行加重趋势;鲁西北、鲁中、鲁西南、半岛地区4种病毒的检出率有差异,其中鲁中地区的BVDV检出率明显高于其他地区(P<0.01)。结果表明,BVDV、BEV、BCo V、BRV 4种病原在山东省奶牛场中流行广泛,以BVDV流行最为严重,尤其是鲁中地区,且有流行加重趋势,成为导致奶牛场犊牛腹泻的主要病毒性因素,建议有针对性地开展防控与净化。本检测初步摸清了山东省不同地区引起奶牛犊牛腹泻相关病毒的感染情况,可为山东省制定奶牛腹泻病综合防控措施提供数据支撑。

一株牛流行热病毒的分离与鉴定

牛流行热病毒(BFFV)是引发世界范围内牛流行热最主要病原之一,给奶牛业的发展造成严重危害。本研究通过RT-PCR对疑似牛流行热奶牛抗凝血样品进行检测,选取阳性样品颅内接种3日龄乳鼠,7日后乳鼠死亡,鼠脑组织通过PCR扩增出BFFV目的条带,乳鼠颅内重复接种3次,乳鼠发病死亡时间明显提前。选取阳性脑组织接种BHK-21细胞,盲传3代后出现明显细胞病变,特异性引物扩增获得目的条带,测序结果与牛流行热病毒序列一致,表明成功分离到一株牛流行热病毒。

一种新的牛支原体膜蛋白p59的表达与鉴定

目的寻找新的牛支原体(Mycoplasma bovis)抗原蛋白并进行原核表达,为牛支原体疫苗的制备奠定基础。方法采用生物信息学方法分析牛支原体PG45株基因组,发现一种新的膜蛋白p59,并对其理化性质、蛋白定位、是否存在信号肽及其互作蛋白进行分析预测。通过PCR扩增p59蛋白编码基因,经酶切连接表达载体pET-30a(+)后转化入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达并进行优化,利用不同浓度咪唑洗脱液来洗脱蛋白。通过Western blot进行鉴定。制备p59重组蛋白兔多抗,通过粘附试验和支原体生长抑制试验验证该重组蛋白的功能。结果生物信息学分析该蛋白可能为ABC转运系统的组成蛋白,其互作蛋白为糖、微量元素摄取的ABC转运系统相关蛋白,可能参与牛支原体摄入营养物质的过程。PCR扩增p59基因,双酶切及测序鉴定pET-30a(+)-p59原核表达载体构建正确,SDS-PAGE分析重组载体转化BL21表达p59重组蛋白,相对分子质量为66×10^3。Western blot鉴定该蛋白为膜蛋白,免疫新西兰兔可刺激产生特异性抗体,即具有抗原性。p59蛋白粘附MDBK细胞试验显示,用p59兔多抗作为一抗时的MDBK(Madin-Darby bovinekidney,牛肾细胞)细胞表面能够粘附更多的P59蛋白,表明p59重组蛋白具有一定的粘附能力。生长抑制试验表明,p59兔多抗能抑制牛支原体在固体培养基中的生长,生长抑制率为45.53%。结论新鉴定的牛支原体膜蛋白p59可能是一种粘附相关蛋白,且具有抗原性,该蛋白多抗血清能抑制支原体的生长,为研究支原体膜蛋白的功能奠定了基础,为牛支原体亚单位疫苗的研制提供了新的靶蛋白。