幽门螺杆菌VacA基因型与耐药性分析

目的探讨幽门螺杆菌(H.pylori)VacA基因型在各种胃肠疾病中的分布及其对常用抗生素的敏感性。方法从胃十二指肠疾病患者胃黏膜标本中分离培养H.pylori,用PCR测定VacA基因型,并采用琼脂稀释法进行对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑3种抗生素的药物敏感性试验。结果 108株H.pylori菌株,VacAs1a阳性85株(78.7%),VacA s1b阳性22株(20.4%),VacA m1阳性29株(26.9%),VacA m2阳性77株(71.3%),VacAs1a/m2阳性66株(61.1%),未发现s2型菌株。其中,慢性胃炎患者VacAs1a阳性率为65.4%(34/52),消化性溃疡患者VacAs1a阳性率为90.0%(36/40),胃癌患者VacAs1a阳性率为93.8%(15/16)。对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑的耐药率分别为18.5%、5.6%、65.7%,对阿莫西林耐药的20株菌株中,19株为VacAs1a型。结论 H.pylori菌株VacA基因型绝大多数为s1a/m2型,该型菌株存在于各种胃肠疾病中。本地区幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率较低,对甲硝唑的耐药率较高,而对阿莫西林耐药的菌株多数为VacAs1a型。

鼻咽癌和肾综合征出血热患者外周血T淋巴细胞亚群的研究

目的：探讨鼻咽癌和肾综合征出血热患者外周血T细胞水平的变化。方法：用流式细胞仪直接免疫荧光法检测健康成人、鼻咽癌（放疗前后）和肾综合征出血热患者外周血T细胞亚群（CD3^3＋、CD4^＋、CD^8＋）的百分率，并进行比较。结果：鼻咽癌患者放疗前后外周血CD8^＋细胞百分率与健康对照组相比明显升高，CD4^＋／CD8^＋比值明显降低，均有显著性差别（P〈0．001）；肾综合征出血热患者与健康对照组相比CD4^＋细胞百分率降低（P〈0．01）、CD8^＋细胞百分率升高、CD4^＋／CD8^＋比值下降（P〈0．001）。结论：鼻咽癌和肾综合征出血热患者体内存在免疫调节功能异常。

具有高效降解地塞米松能力的伯克霍尔德菌CQ001株的分离及功能基因组学分析

目的研究细菌对地塞米松类甾体激素的降解作用及其分子机制,为构建清除水环境医源性地塞米松类药物污染的工程菌奠定基础。方法采用富集培养法从医院废水中分离降解地塞米松的细菌,采用固相萃取-高效液相色谱(HPLC)法检测细菌对地塞米松的降解效能,通过16S r DNA序列测定进行鉴定。用Illumina Hiseq4000结合第三代测序技术对降解菌的全基因组测序,并进行序列组装、注释和分析,对降解地塞米松相关基因进行RT-q PCR验证。结果分离到1株对地塞米松有较高降解作用的细菌,经鉴定属于伯克霍尔德菌属(Burkholderia),命名为Burkholderia sp.CQ001。该菌对地塞米松磷酸钠及地塞米松的降解率分别为84.8%和77.11%。全基因组测序表明Burkholderia sp.CQ001包含2条染色体和4个巨型质粒,与代谢相关基因大部分集中在2号染色体上,共3 260 157 bp。生物信息学分析表明,该菌含有甾体代谢通路中许多重要酶类的编码基因,其中与地塞米松降解相关的有ABC转运子,3-甾酮-9α-脱氢酶等,这些基因在以地塞米松磷酸钠为碳源的培养条件下表达量不同程度地高于以蔗糖为碳源的培养条件。结论 Burkholderia sp.CQ001是一株具有强大的代谢功能和代谢途径丰富的细菌,具有降解地塞米松类甾体激素的性能,该菌株为后续研究甾体激素的降解机制和构建清除水环境医源性地塞米松类药物污染的工程菌提供了菌种。

幽门螺杆菌感染途径的探讨

目的检测幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者的粪便是否存在活的Hp,以探讨Hp的传播途径。方法收集60例胃粘膜快速尿素酶试验强阳性患者的胃粘膜和新鲜粪便,进行Hp的分离培养和PCR检测。结果52份胃粘膜标本分离到Hp,阳性率86.7%;6份粪便标本分离到Hp,阳性率10.0%,其中4份来自慢性胃炎患者,2份来自消化性溃疡患者。粪便培养阳性的患者胃粘膜培养均阳性;PCR检测同一患者两种标本分离菌株的细胞毒素相关蛋白基因(CagA)和空泡毒素信号序列s1a基因(VacA s1a)一致,其中4株为CagA+和VacA s1a+,另2株VacA s1a+和尿素酶A亚单位(UreA)基因阳性。结论Hp感染者的粪便中有活的Hp存在,该菌可能通过粪-口途径传播。

分枝杆菌噬菌体D29裂解酶gp10的原核表达及抗脓肿分枝杆菌活性

目的克隆并原核表达分枝杆菌噬菌体D29裂解酶gp10基因,观察重组蛋白对脓肿分枝杆菌的抑菌作用。方法以噬菌体D29基因组DNA为模板,PCR扩增gp10基因片段,克隆至pET-32a(+)载体上,构建重组原核表达质粒pET-32a-gp10,转化E.Coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,亲和层析纯化后,采用杯碟法检测其抑菌活性。结果 PCR扩增获得长1 454 bp的gp10基因片段,重组表达质粒pET-32a-gp10经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为54 800,表达量占菌体总蛋白的97.4%,破菌上清及破菌沉淀中均可见目的蛋白的表达,纯化后纯度可达90%,浓度为0.5 mg/ml;重组蛋白对脓肿分枝杆菌有抑菌作用。结论已成功表达重组分枝杆菌噬菌体D29裂解酶gp10,其对脓肿分枝杆菌具有抑菌作用,为抗脓肿分枝杆菌及其他非结核分枝杆菌感染新药物的研制提供了依据。

肠产毒性大肠埃希菌F4ac菌毛蛋白FaeG亚单位的原核表达及免疫学鉴定

目的克隆并表达肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG,为制备预防幼畜ETEC感染的疫苗奠定基础。方法以ETEC(C83902)基因组DNA为模板,PCR扩增faeG基因,插入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建重组质粒pGEX-faeG。将pGEX-faeG转化大肠埃希菌BL-21I,PTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Western blot鉴定其抗原性。将表达菌超声破碎后离心提取包涵体制备抗原,经口灌喂免疫小鼠,检测小鼠血清中抗FaeG的IgGI、gA,鉴定其免疫原性。结果扩增的faeG基因全长786 bp,与基因文库中的faeG基因同源性达96%。重组质粒pGEX-faeG经PCR及双酶切鉴定确有插入片段,且序列完整。表达产物FaeG相对分子质量约53 kD,主要存在于碎菌后的沉淀中,以包涵体形式表达。Western blot显示该蛋白可与ETEC F4ac阳性血清特异性结合,免疫后小鼠血清抗FaeG IgGI、gA明显高于PBS和GST对照组。结论成功构建了ETEC F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG的重组质粒pGEX-faeG,表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制预防幼畜ETEC感染的疫苗。