表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌分批补料培养工艺优化

人胰高血糖素样肽-1(Glucagon Like Peptide-1,GLP-1)是一种有潜在应用价值的治疗糖尿病的药物。今以一株表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌为研究对象,在分批培养条件下,通过流加甘油并在诱导前0.5h添加氮源使菌体密度、融合蛋白表达水平、融合蛋白体积得率和融合蛋白细胞得率分别提高了138.0%、29.5%、216.9%和29.6%。在此基础上,进一步考察了甘油补加策略、氮源补料方式以及补氮液浓度等过程因素对菌体生长以及GLP-1融合蛋白表达的影响,发现氮源流加过程是提高融合蛋白表达水平的关键因素。进而通过对补料过程的优化,建立了高密度高表达的分批补料培养工艺,最终使菌体密度、融合蛋白表达水平、融合蛋白体积得率和融合蛋白细胞得率分别达到51.93g·L-1、34.6%、2.937g·L-1和0.057g·g-1cell,较分批培养分别提高了314.5%、100.0%、784.6%和111.1%。研究结果对GLP-1融合蛋白的产业化开发有一定的指导意义。

重组大肠杆菌HT02高密度高表达HT-1融合蛋白发酵过程优化

发酵工艺放大是将实验室成果产业化的必要一环,随着发酵规模的扩大,工艺流程也会有相应的调整,导致微生物所处的生长环境以及生长代谢状态的改变,从而影响大体积发酵罐的发酵水平。本文以一株产HT-1融合蛋白的重组大肠杆菌HT02为研究对象,在200L发酵罐中研究了分批补料培养时菌体生长与HT-1融合蛋白表达的特性,通过采用提前诱导、增加接种量的手段,解决了因增加二级种子培养工艺而导致的200L发酵罐中HT-1融合蛋白表达水平下降的问题,最终使菌体密度、HT-1融合蛋白表达水平、融合蛋白细胞得率以及融合蛋白体积得率分别达到55.1g·L-1、27.4%、0.056g·(gcell)-1和3.103g·L-1,较工艺改进前发酵水平分别提高了9.8%、23.4%、14.3%和25.2%,实现了在200L发酵罐中高密度高表达发酵,为HT-1工业化生产提供了指导。

碳源对重组大肠杆菌发酵生产GLP-1融合蛋白的影响

以一株表达人胰高血糖素样肽-1融合蛋白的重组大肠杆菌为研究对象,首先通过摇瓶实验对碳源种类进行了初步选择,发现葡萄糖和甘油对菌体生长以及GLP-1融合蛋白表达较为适宜。进一步在5 L反应器上对初始葡萄糖及甘油浓度进行了考察,发现高浓度碳源有利于菌体生长却抑制GLP-1融合蛋白表达,但能提高GLP-1融合蛋白的体积得率。在0.25%初始葡萄糖或甘油存在的条件下,在培养过程中流加葡萄糖或甘油维持其在发酵液中的浓度,比较了两者对菌体生长以及GLP-1融合蛋白表达的影响,结果发现,以甘油为碳源时,菌体生长以及GLP-1融合蛋白的表达量均高于以葡萄糖为碳源的结果,最终发酵液的菌浓(OD_(600))可达到25.4,较葡萄糖为碳源时19.1提高了33.0%,GLP-1融合蛋白表达水平和体积得率分别可达到22.4%和1.051 g/L,较葡萄糖为碳源的15.8%和0.504 g/L分别提高41.8%和108.5%。该结果对GLP-1融合蛋白表达菌株发酵条件的进一步优化提供了依据。

pH值和盐浓度对金属螯合亲和层析分离人胰高血糖素样肽-1融合蛋白的影响

目的探讨pH值和盐浓度对金属螯合亲和层析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)分离含His-Tag标签的人胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)融合蛋白的影响,并确定最佳洗脱条件。方法在0.50mol/L盐浓度条件下,分别取pH6.0、7.0、7.8和9.04种缓冲液进行咪唑梯度洗脱;在合适的pH值条件下,分别取氯化钠浓度0.25、0.50和0.75mol/L3种缓冲液进行咪唑梯度洗脱。分析在不同pH值及盐浓度条件下洗脱融合蛋白所需要的咪唑浓度及回收率。结果在所考察的pH值范围内,洗脱融合蛋白所需的咪唑浓度随洗脱液pH值的升高而逐渐降低,当洗脱液pH值为7.8时,融合蛋白的分离效果最佳,大部分杂蛋白被0～40mmol/L咪唑洗脱液去除且不含融合蛋白,而绝大部分融合蛋白在咪唑浓度达80～200mmol/L时被洗出,总回收率达(83.7±1.0)%,且比例较高;在此pH值条件下,氯化钠浓度达0.75mol/L,才会影响融合蛋白的回收率,氯化钠浓度为0.25或0.50mol/L的洗脱液洗出融合蛋白的效果相近;在pH7.8,含0.25mol/L氯化钠的洗脱体系下,用50mmol/L咪唑溶液洗脱杂蛋白,200mmol/L咪唑溶液洗脱融合蛋白,融合蛋白的回收率和比例分别可达(85.2±2.0)%和(80.5±1.0)%。结论在所考察的pH值和盐浓度范围内,提高洗脱液pH值和盐浓度均可降低洗脱融合蛋白需要的咪唑量,但也会降低融合蛋白的回收率。

卡介苗生产工艺、质量、使用现状及新型结核病疫苗的发展趋势

卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)目前仍是WHO推荐预防结核病(tuberculosis,TB)的唯一疫苗,对儿童中的结核性脑膜炎及播散性TB具有较好的预防作用,可降低重症TB的风险。虽然新生儿接种BCG效果肯定,但对多数成人肺部疾病的预防作用不一,防治效果差异显著。本文对TB及BCG免疫现状,BCG菌种特性、生产工艺、质量标准、质量风险、接种和接种后异常反应,以及发展现状和发展趋势等方面作一综述,并对BCG的发展及改进提出建议,对BCG的非特异性保护作用及新型TB疫苗的研究进展进行展望。

皮内注射用卡介苗生产场地变更质量可比性研究

目的 对发生场地变更的皮内注射用卡介苗产品进行关键质量要素对比和分析,确认变 更后产品质量与变更前一致.方法 对新老车间卡介苗产品关键质量指标进行分析,同时对卡介苗成品稳定性、卡介菌结构特异性、卡介苗成品动物安全性等方面进行比较研究.结果 新老车间卡介苗产品的关键质量指标均符合相关规定要求,其中新车间卡介苗半成品沉降率为4.55%~10.00%,半成品活菌数为(1.82~2.93)×107菌落形成单位/mg,成品活菌数为(3.34~4.97)×106菌落形成单位/mg,均在老车间历史数据警戒限范围以内.新老车间生产的卡介苗成品的稳定性、卡介菌结构特异性和产品安全性等实验结果 均符合相关规定要求.结论 卡介苗生产场地变更未对产品质量产生不利影响.

皮内注射用卡介苗关键质量指标关联性分析

目的对皮内注射用卡介苗(卡介苗)关键质量指标进行关联性分析,为生产工艺控制提供一定的依据。方法用统计软件对211批卡介苗的菌种代次、半成品沉降率、半成品活菌数、成品活菌数、成品效力和成品渗透压摩尔浓度等关键质量指标进行统计分析,探寻各指标间相互影响的规律。结果用第6、9和12代卡介菌生产的卡介苗成品活菌数均值分别为5.07×106、5.49×106和6.02×106菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)/mg,Pearson相关系数为0.200(P<0.05),成品活菌数随生产用菌种代次的升高而略有增加。半成品沉降率处于0.00%~7.99%、8.00%~11.99%和12.00%~20.00%的卡介苗成品活菌数均值分别为5.57×106、5.52×106和5.06×106 CFU/mg,Pearson相关系数为-0.182(P<0.05),成品活菌数随半成品沉降率提高而略有降低。半成品活菌数处于1.00×107~1.99×107、2.00×107~2.99×107和3.00×107~4.00×107 CFU/mg的卡介苗成品活菌数均值分别为4.61×106、5.69×106和6.53×106 CFU/mg,Pearson相关系数为0.537(P<0.05),成品活菌数随半成品活菌数增加而显著增加。成品活菌数处于1.00×106~3.99×106、4.00×106~5.99×106和6.00×106~8.00×106 CFU/mg的卡介苗成品效力均值分别为17.61、16.51和16.55 mm,Pearson相关系数为-0.187(P<0.05),成品效力随成品活菌数增加而先略有降低再趋于平稳。成品活菌数处于1.00×106~3.99×106、4.00×106~5.99×106和6.00×106~8.00×106 CFU/mg的卡介苗成品渗透压摩尔浓度均值分别为363.61、363.21和368.68 mOsmol/kg,Pearson相关系数为0.210(P<0.05),成品渗透压摩尔浓度随着成品活菌数增加而略有升高。结论在企业标准范围内,成品活菌数受半成品活菌数的影响较大,受菌种代次、半成品沉降率的影响较小。成品活菌数对成品效力和成品渗透压摩尔浓度的影响较小。

皮内注射用卡介苗与直接接触的包装容器的相容性

目的考察皮内注射用卡介苗与其直接接触的包装容器的相容性,评估疫苗现用包装容器低硼硅玻璃安瓿的适宜性。方法分别检测已包装的皮内注射用卡介苗在加速条件及长期规定储存条件下,疫苗及低硼硅玻璃安瓿的外观、安瓿中有毒有害金属离子(As、Sb、Pb、Cd)迁移量、安瓿内表面脱片风险等,同时分析安瓿对疫苗质量的影响程度及安瓿是否被疫苗腐蚀受损。结果3批皮内注射用卡介苗在23~27℃放置6个月、2~8℃放置30个月,安瓿中有毒有害金属离子迁移至疫苗中的量远低于安全限值,As迁移量为0.001~0.006μg/支、Sb迁移量≤0.005μg/支、Pb迁移量为0.028~0.080μg/支、Cd迁移量为0.007~0.018μg/支;低硼硅玻璃安瓿内表面被疫苗腐蚀脱片的风险较低。3批皮内注射用卡介苗在23~27℃放置6个月和2~8℃放置27个月,疫苗及低硼硅玻璃安瓿外观与0个月一致;关键质量检定结果水分为1.5%~2.4%、渗透压摩尔浓度为342~378 mOsmol/kg、活菌数为(3.61~7.75)×10^(6)CFU/mg、效力为15~20 mm,均合格。结论皮内注射用卡介苗与低硼硅玻璃安瓿发生相互作用的风险可接受,相容性良好,表明现用低硼硅玻璃安瓿是适宜的。