表达AAL蛋白重组减毒猪霍乱沙门菌的构建及生物学特性评价

为构建表达橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)的重组减毒猪霍乱沙门菌,将AAL基因克隆至原核表达载体pTrc-His2A,并通过电穿孔的方法将重组质粒pTrc-AAL转化至减毒猪霍乱沙门菌ΔRposΔslyAΔslrp内,获得了重组减毒沙门菌ΔRposΔslyAΔslrp(pTrc-AAL),利用Western-blot检测AAL蛋白的表达,并对重组菌株的生物学特性进行评价。结果显示,携带AAL基因的重组减毒沙门菌ΔRposΔslyAΔslrp(pTrc-AAL)构建成功并表达AAL蛋白;重组菌株ΔRposΔslyAΔslrp(pTrc-AAL)的生理、生化特性与ΔRposΔslyAΔslrp(p Trc-His2A)菌株相似;与野生株(WT)相比,重组菌株ΔRposΔslyAΔslrp(pTrc-AAL)在对数期的生长速度略慢于野生株,且对抗生素氨苄西林和阿莫西林敏感,而运动性和生化特性与野生株相比无显著变化;LD50结果显示,重组菌株ΔRposΔslyAΔslrp(pTrc-AAL)的LD50较野生株提高了8.81×10^(5)倍以上。综上所述,本研究成功构建了表达外源蛋白AAL的重组减毒沙门菌ΔRposΔslyAΔslrp(pTrc-AAL),为深入探究AAL生物学功能和开发靶向M细胞的黏膜疫苗奠定了基础。

利用昆虫细胞表达猪RANKL蛋白及其生物学活性分析

将猪RANKL基因克隆至杆状病毒供体质粒pFastBacHTA中,经酶切鉴定及测序筛选出阳性重组供体载体pFastBacHTA-RANKL,将其转化至含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子Bacmid-RANKL,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得含RANKL基因的重组杆状病毒。经SDS-PAGE分析、Western-blot分析以及IFA试验,证明RANKL基因在sf9细胞中成功表达。利用表达的RANKL蛋白刺激IPEC-J2细胞,采用qPCR方法检测处理后细胞中M细胞相关标志基因的表达。结果显示,与阴性对照组相比,猪RANKL处理后的细胞中M细胞特异性的标记基因CK-18、Marcksl1、Sgene1、Spib、CCL20、UBD、NCF4、TRAF6表达量都显著上调。这表明本研究表达的猪RANKL具有良好的生物学活性,可成功诱导IPEC-J2细胞向M细胞分化。本研究结果为后续进一步研究猪肠道M细胞的分化,及研制增强猪肠道黏膜免疫应答的M细胞靶向疫苗打下了良好的物质基础。

减毒猪霍乱沙门菌ΔaroAΔaroB缺失株的构建与生物学特性研究

以猪霍乱沙门菌为亲本菌株,利用λRed同源重组技术,构建了△aroA、△aroB和△aroA△aroB 3株猪霍乱沙门菌基因缺失菌株。生理、生化分析结果显示:在对数生长期,3株基因缺失菌株的生长速度略慢于亲本菌株,其生化特性和药敏特性与亲本菌株无显著差异,可在体外稳定传代。将其在小鼠体内进行毒力测试,结果表明,△aroA△aroB双基因缺失株在小鼠上的毒力较亲本菌株降低1.02×107以上。免疫保护分析结果表明,△aroA△aroB双基因缺失菌株可为小鼠抵御629.9 LD50亲本菌株攻击提供100%保护,也可为抵御6299 LD50亲本菌株侵袭提供40%保护。综上所述,成功构建了3株猪霍乱沙门菌减毒菌株,其中,△aroA△aroB减毒菌株具有良好的安全性和免疫保护效果,为进一步开发猪沙门菌减毒活疫苗奠定了坚实的基础。