JEV、PRRSV、PPV及PRV多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能快速鉴别猪日本脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的准确、高效的多重常规PCR检测方法,针对JEV、PRRSV、PPV、PRV基因保守区域合成特异性引物,优化后获得最优反应条件,对该方法特异性、敏感性、重复性进行了测定,并应用该方法对临床样品进行初步应用。结果显示,该方法对JEV、PRRSV、PPV、PRV可进行特异性扩增,对混合阳性质粒检测下限达2×10^(6)copies/μL,对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒等相关病毒均无扩增,且重复性良好。用该方法检测51份2021年采集的广西区内组织样品,检出JEV、PRRSV、PPV、PRV阳性率分别为7.84%、50.98%、5.88%、23.53%,且存在多重混合感染的情况。所建立的多重PCR方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,可应用于临床常见猪繁殖障碍性病毒病的快速诊断和监测预警,为猪繁殖障碍性病毒病提供了诊断技术支持。

猪急性腹泻综合征冠状病毒病原学及防治研究现状

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是2017年首次在中国广东发现的一种新型猪肠道冠状病毒,可引发新生仔猪剧烈呕吐、腹泻、严重脱水甚至死亡。除了对养猪业造成直接威胁外,SADS-CoV还具有潜在的广泛种属嗜性,可能对公共卫生造成威胁。文章对该病毒的分子病原学、检测方法和防治策略进行综述,以期为后续SADS-CoV的科学研究和有效防治提供参考借鉴。

迷迭香提取物降低仔猪断奶氧化应激的机制研究

试验旨在研究迷迭香提取物对断奶仔猪氧化应激的影响。选择144头体重8.0 kg左右、26日龄断奶的“杜×长×大”三元杂交仔猪,随机分为4组,每组6个重复,每个重复6头仔猪(公、母各半)。对照组仔猪饲喂基础日粮,试验组(200、400、600 mg/kg RE组)分别在基础日粮中额外添加200、400、600 mg/kg迷迭香提取物(RE)。试验期24 d。结果显示,与对照组相比,添加200 mg/kg RE能够显著提高仔猪平均日增重和平均日采食量(P<0.05),显著降低料重比(P<0.05)。试验第10 d,与对照组相比,试验组断奶仔猪血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高(P<0.05),600 mg/kg RE组断奶仔猪血清中过氧化氢酶(CAT)活性显著升高,丙二醛(MDA)含量显著下降(P<0.05);试验第10 d,200 mg/kg RE组断奶仔猪血清中胰岛素样生长因子1(IGF-I)和胃饥饿素(Ghrelin)水平显著提高(P<0.05),400 mg/kg RE组断奶仔猪血清中生长激素(GH)水平显著提高(P<0.05);试验第24 d,200 mg/kg RE组断奶仔猪血清中IGF-I和GH水平显著提高(P<0.05),600 mg/kg组断奶仔猪血清中IGF-I水平显著提高(P<0.05)。研究表明,日粮添加RE能够缓解仔猪早期断奶引起的氧化应激,促进断奶仔猪的生长发育,增强仔猪抗氧化能力,适宜添加量为200 mg/kg。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达、纯化及鉴定

【目的】通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1,为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持。【方法】以含A型FMDV VP1基因的重组质粒p MD18-T-A-VP1为模板,通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因,构建表达质粒p ET-32a-VP1和p GEX-6p-1-VP1,然后转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白。【结果】诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在,分别经His·Bind和GST·Bind柱层析纯化,SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高;Western blotting检测分析发现,VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合,但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应。【结论】经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性,可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查。

广西野鸟H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

【目的】探讨H9N2亚型流感病毒在野鸟中的存在与传播,为广西流感疫情动态监测和防控及人流感预防监测提供重要依据。【方法】采集广西野鸟肺脏组织,将病料接种于9~11日龄SPF鸡胚尿囊腔进行分离培养,血清学试验鉴定HA和NA亚型,并克隆扩增其HA和NA基因。【结果】该分离株能被H9亚型阳性血清抑制,神经氨酸酶抑制（NI）试验结果将其鉴定为N2亚型,判断该病毒属于H9N2亚型流感病毒,命名为A/wildbird/Guangxi/H2/07,对HA和NA基因进行序列分析,发现与流感病毒H9亚型和N2亚型同源性最高,分别达到82.4%~99.0%和83.1%~99.9%。【结论】H9N2亚型流感病毒已在广西野鸟中存在,该结论为广西流感疫情动态监测和防控提供了重要依据。

广西鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的东北白鹅α干扰素(IFN-α)基因(AY524422)序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR从经鹅副粘病毒(GPMV)刺激培养的鹅外周血淋巴细胞中克隆获得广西鹅IFN-α基因,将其连接pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞后进行序列分析。结果表明,广西鹅IFN-α基因完整的开放阅读框大小为576 bp,共编码192个氨基酸残基,其推导的氨基酸中有7个半胱氨酸残基和2个潜在的糖基化结合位点(NDT和NHT)。与GenBank上已公布的其他IFN-α基因进行同源性比较分析,发现广西鹅IFN-α基因与东北白鹅的同源性最高(核苷酸同源性为98.3%、氨基酸同源性为96.4%),与鸡、牛、猪、鼠、犬、人等的同源性较低。说明IFN具有种属特异性,且亲缘关系越近同源性越高,这与物种之间的进化亲缘关系一致。

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒(CSFV)TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。

猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型和3型多重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速、特异的猪肺炎支原体(Mhp)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的多重荧光定量PCR鉴别检测方法,根据Mhp、PCV2和PCV3及β-actin基因保守区域序列,设计合成4对特异性引物及4种荧光基团标记的Taq Man探针。构建含有各目的基因的重组质粒标准品,筛选引物,优化反应条件,成功建立多重荧光定量PCR后评价该方法的特异性、敏感性、重复性并将该方法初步应用于临床样品检测。结果显示,该方法能同时特异性地鉴别检测Mhp、PCV2和PCV3,检测PRRSV、CSFV、PRV、JEV、PPV、PEDV、TGEV、FMDV病毒核酸无交叉反应;对Mhp、PCV2、PCV3和β-actin标准质粒的最小检出量分别为26.4、66.7、25.6、5990 copies/μL;该方法重复性好,组间和组内试验变异系数低于1.5%;用该方法检测101份临床样本,Mhp、PCV2和PCV3阳性率分别为20.8%、36.6%和33.7%。建立的多重荧光定量PCR方法能同时快速和定量检测Mhp、PCV2和PCV3,较普通PCR更敏感,实用性强,有效避免了多次检测耗时长、费用高的问题,为Mhp、PCV2和PCV3的监测和防控提供了可靠的检测技术。

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

【目的】了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。【方法】采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPI)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析。【结果】从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽I型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60h,ICPI为1.45;分离株F基因112～117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%。【结论】猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA检测方法的初步建立

用纯化的融合蛋白p GEX-6p-1-VP1作为包被抗原,4E12单抗为检测抗体与待检血清竞争固相抗原,建立了单抗竞争ELISA方法来检测口蹄疫A型抗体,并进行了反应条件的优化,确定阴阳临界值。结果表明,抗原最适包被浓度为0.625μg/m L,待检血清稀释度为1∶2,单抗最大稀释度为1∶400,酶标抗体工作浓度为1∶5000,封闭液、待检血清和单抗作用时间分别为60、60、45 min;阴阳性判断抑制率(PI)≥30%为阳性。与液相阻断ELISA检测试剂盒比对,符合率为84.8%。试验表明,建立的单抗竞争ELISA检测方法具有特异性强、稳定性好等优点,可用于口蹄疫A型血清抗体的检测,这为口蹄疫A型免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了深入了解VP1蛋白的结构和功能,并建立A型口蹄疫(FMD)血清抗体检测方法,试验采用纯化的重组蛋白p ET-32a-VP1免疫Balb/c小鼠,以纯化的重组蛋白p GEX-6p-1-VP1作为检测抗原包被酶标板检测抗体效价。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,其杂交瘤细胞用间接ELISA法进行筛选,获得4株能稳定分泌抗口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为1D10、3D12、4E12和5G7。结果表明:这4株单克隆抗体均为Ig M亚型和κ轻链,单克隆抗体间可能识别同一个表位,或表位重叠性大。4株单克隆抗体均能被A型FMDV阳性血清所阻断,具有特异性,且以单克隆抗体4E12产生的抗体效价最高、稳定性强、亲和力最大,并能与重组蛋白FMDV-A-VP1特异性结合。说明单克隆抗体4E12可作为单克隆抗体竞争ELISA法的竞争抗体用于检测A型FMDV血清抗体。

白鹭源禽Ⅰ型副粘病毒L基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株全基因组序列设计5对引物,采用RT-PCR扩增出白鹭源禽I型副粘病毒(W13株)L基因的LA(1121 bp)、LB(1481 bp)、LC(1439 bp)、LD(1476 bp)、LE(1608 bp)5个片段,用DNA Star软件比较分析后进行拼接,获得长约6760 bp包含有L基因全长的核苷酸序列,而W13株L基因的mRNA全长为6704 bp、开放阅读框(ORF)为6615个碱基、编码2204个氨基酸。氨基酸同源性分析表明:W13株L基因与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过97.0%;而核苷酸同源性分析表明:W13株L基因与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过93.0%。可见,W13株与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的亲缘关系较近。

鹅源H9N2亚型禽流感病毒PB2和PB1基因序列分析

采用RT-PCR方法对1株鹅源H9N2亚型禽流感病毒(GS/GX/01/07)RNA聚合酶基因PB2和PB1分别进行了扩增,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定与分析。结果表明,该株病毒的PB2、PB1开放阅读框(ORF)分别由2 280和2 277个碱基组成,分别编码759和758个氨基酸。经同源性和系统进化树分析,该毒株RNA聚合酶基因PB2和PB1与H9N2亚型欧亚谱系中的第2亚群代表株QA/HK/G1/97的核苷酸和氨基酸同源性在95%以上,亲缘关系较近。

莽草酸对PEDV感染仔猪生长性能、腹泻指数、血清免疫及抗氧化指标的影响

试验旨在研究莽草酸对感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)仔猪的生长性能、腹泻指数、血清免疫及抗氧化指标的影响。将120头感染PEDV的7日龄“杜×长×大”仔猪随机分为6组,每组5个重复,每个重复4头猪。处理1组、2组、3组分别每日给感染PEDV仔猪灌服800、400、200 mg/kg莽草酸,处理4组每日给感染PEDV仔猪灌服400 mg/kg绿原酸,处理5组每日给感染PEDV仔猪灌服2万单位庆大霉素,处理6组为阳性对照组,另选选择20头健康仔猪作为空白对照组。试验期为5 d,之后观察3 d。结果显示,与阳性对照组相比,处理1组、2组、3组仔猪平均日增重(ADG)均显著升高(P<0.05)。处理1组和2组仔猪的PEDV感染治愈率均达到85%,处理5组仔猪的PEDV感染治愈率为65%;处理1组、2组、3组仔猪血清中的免疫球蛋白G(IgG)含量均显著升高(P<0.05);处理1组、2组、3组仔猪血清中的总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮(NO)、髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)显著升高(P<0.05);丙二醛(MDA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)水平显著降低(P<0.05)。研究表明,莽草酸能够提高仔猪的生长性能,降低腹泻指数,增强血清免疫力和抗氧化能力,对PEDV感染仔猪具有抗病促生长作用。

牛羊生产课程思政的探索和实践

根据高职院校畜牧兽医专业人才培养的特点,按照牛羊生产课程标准的要求,从课程思政教学理念和教学原则来探索牛羊生产课程思政,从教学准备中挖掘思政元素,在教学过程中渗透思政教学,以此确保牛羊生产课程思政的实践,为牛羊生产项目化改革教学提供思路,有利于培养高素质专业人才,助力牛羊产业高质量发展。

绿原酸促进母猪繁殖性能的效果研究

试验旨在研究在日粮中添加绿原酸对母猪繁殖性能的影响。选取48头体重相近、胎次相近、同期发情的妊娠母猪,随机分4组,每组4个重复,每个重复3头猪。对照组母猪饲喂基础日粮,试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别在基础日粮中添加200、400、600 mg/kg绿原酸。结果显示,试验Ⅱ组母猪产仔总数、产活仔数、产健仔数、仔猪初生窝重均显著高于其他组(P<0.05)。试验Ⅱ组21 d断奶仔数、断奶窝重显著高于其他组(P<0.05)。试验Ⅱ组、Ⅲ组母猪血清免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白A (IgA)、免疫球蛋白M (IgM)含量显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,试验Ⅱ组、Ⅲ组仔猪血清IgG、IgA、IgM含量显著提高(P<0.05)。研究表明,绿原酸可以提高母猪繁殖性能,增强母猪和仔猪的免疫力,适宜添加水平为400 mg/kg。

广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组序列分析

【目的】了解广西猪源H9N2亚型流感病毒的来源及变异情况,为有效防控广西猪源H9N2亚型流感病毒奠定基础。【方法】运用RT-PCR对广西分离株A/SW/GX/S11/05(H9N2)进行全基因组扩增,并克隆测序及对比分析。【结果】扩增获得的HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因片段长度分别为1683、1401、1497、1027、890、2233、2280和2151bp,其推导氨基酸分别为561、467、499、349、338、744、760和717aa。经过序列分析,发现各基因片段的核苷酸及其推导氨基酸与A/Bird/GX/62/05株的同源性最高,分别为96.2%～100.0%和98.5%～99.6%;系统进化分析也表明A/SW/GX/S11/05株与A/Bird/GX/62/05株的亲缘关系最近。【结论】广西猪源H9N2亚型流感病毒属于欧亚谱系的北京亚系,且在一定时间内不同宿主间均有感染,在今后的流感病毒防治工作中,跨种属传播是一个不可忽视的问题。

马源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

【目的】了解广西马源Ⅰ型副粘病毒的生物特性,为今后有效防控副粘病毒在不同宿主间传播提供科学依据。【方法】用SPF鸡胚对广西百色疑似病马组织悬浮液进行病原分离培养后,经血清学试验和致病性试验鉴定,再用RT-PCR对分离株F基因进行扩增,并对扩增片段进行测序分析。【结果】分离获得的病毒能使鸡红细胞发生凝集,且这种凝集可被鸡新城疫(ND)标准阳性血清所抑制,HA和HI效价分别为27和210。分离株毒力试验结果显示,鸡胚平均死亡时间(MDT)为72 h,雏鸡脑内接种致死指数(ICPI)为1.48,属中发型毒株。分离株与禽I型副粘病毒基因Ⅶ型毒株NDV04-21、TW-96p的核苷酸同源性分别为95.9%和95.1%;基于F基因的遗传分型进化树显示,分离株与NDV04-21、TW-96p处于同一进化树分支,属于禽I型副粘病毒基因Ⅶ型;分离株F蛋白112～117裂解位点氨基酸序列与标准强毒株F48E9、HER33的一致,在第112～117位氨基酸序列为3'-R-R-Q-R-R-F-5'。【结论】广西马群已有禽I型副粘病毒存在,再次证实广西地区禽I型副粘病毒宿主范围在不断扩大。

马源禽Ⅰ型副黏病毒HN基因的克隆与序列分析

为了解禽Ⅰ型副黏病毒的跨种传播以及对HN基因进行序列分析,运用RT-PCR方法,扩增马源禽I型副黏病毒广西分离株M10株的HN基因,将其克隆至PMD18-T载体中,进行序列测定,序列分析表明,M10株的HN基因片段长度约为2.0kb,ORF为1716个碱基,编码571个氨基酸;ORF区与参考毒株的核苷酸同源性为80.9%-99.2%,推导的氨基酸同源性为88.6%-98.6%。在同源性比较的基础上,进一步绘制禽I型副粘病毒HN基因的系统进化树,分析表明,M10株与参考毒株YG03、NDV-03、FP1等亲缘关系较近。

替抗添加剂对保育猪生长性能、血清中内毒素及免疫抗病性能的影响

试验旨在研究使用酸化剂、益生菌、中草药3种添加剂对保育猪的血清中内毒素以及免疫抗病性能的影响。随机选取28～30日龄"杜×长×大"断奶仔猪500头,平均分成5个试验组(A、B、C、D、E),A组为空白对照组,B组为酸化剂组,C组为益生菌组,D组为中草药组,E组为抗生素组。从仔猪断奶后开始饲喂,记录各组仔猪的生长性能及腹泻率,试验期为30 d。试验后,各组之间的平均日增重和料肉比无显著差异(P>0.05),B、C、D组的腹泻率比A组分别降低了52.00%、6.46%、20.00%,比E组分别降低了72.24%、45.91%、53.73%,D组的成活率为100%;B组RBC总数显著高于C组(P<0.05),极显著高于D组(P<0.01),B、C、D组WBC含量比试验前极显著升高(P<0.01);E组IgG水平显著低于A、D组(P<0.05),各组IgM含量呈上升趋势,但差异不显著(P>0.05);E组内毒素浓度极显著高于其他各组(P<0.01)。试验结果表明,试验所使用的酸化剂、益生菌和中药配方这3种替抗添加剂,能够显著降低保育猪血清中内毒素含量,增强仔猪的免疫力和减少仔猪腹泻的发生,其中以酸化剂效果最佳。