基于CRISPR/Cas9系统构建青鳉突变体

青鳉是研究基因功能、器官发生和发育机制的模式生物之一,基因编辑技术已在青鳉中得到广泛应用,但利用CRISPR/Cas9技术构建青鳉突变体的详细过程还未见报道。为了完整详细地阐明青鳉突变体的构建过程,实验以青鳉Olpax6.1基因的敲除为例,首先利用ChopChop网站设计获得Olpax6.1基因gRNA的靶点;其次通过PCR扩增和质粒酶切分别获得gRNA和Cas9 mRNA体外转录的模板,并通过体外转录合成gRNA和Cas9 mRNA;再将Cas9 mRNA和gRNA混合进行青鳉胚胎显微注射获得突变F_(0);最后利用PCR、T7EndonucleaseⅠ酶切和Sanger测序筛选F_(0)与野生型杂交的子代获得相同突变类型的F_(1),进而将相同突变的F_(1)进行杂交并筛选其子代,获得青鳉Olpax6.1敲除的纯合突变体,纯合突变体表现出眼部发育畸形的经典表型。本研究为青鳉突变体的构建提供详细完整的实验方案,同时也为其他鱼类突变体的构建提供技术参考。