泛肿瘤基因突变检测高通量测序基因包的开发及临床验证

目的:本研究旨在开发高通量测序基因包(panel)以实现个性化的泛肿瘤突变基因的检测,同时验证其临床适用性。方法:通过公开数据库选择并设计223个肿瘤相关基因的引物组成panel,并以菁良公司的不同百分比结构变异福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)标准品、野生型标准品、泛肿瘤800标准品、Horizon Discovery公司的游离DNA标准品为样本完成本panel准确性、重复性和检测限的实验室验证,并利用10例组织样本和2例游离DNA样本进行临床验证。结果:在准确性上,本panel阳性和阴性检出符合率达到100%。在重复性上,利用5%结构变异FFPE标准品具有良好的重复性,而游离DNA标准品重复性一般。在最低检测限上,2.5%结构变异FFPE标准品可稳定检出,最低可检出1%结构变异标准品;游离DNA标准品的最低检测限为0.25%。利用本panel检测临床样本表现出与对照方法良好的一致性。结论:成功开发靶向针对223个肿瘤相关基因的高通量测序panel并完成了分析性能和临床适用性验证,该方法具有协助临床诊断与治疗的潜力。

数字PCR在几种常见人类传染病研究中的应用

聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)是现代分子生物学的基础,被广泛应用于核酸的定性及定量分析,是人类传染病病毒核酸分析的核心技术。数字PCR(digital polymerase chain reaction,d PCR)作为一种新兴的核酸定量分析技术,具有高精确度、高精密度等优点。它打破了传统实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)技术的局限,不依赖于标准曲线,直接检测样本中靶片段的拷贝数,是一种更为简单且实用的核酸绝对定量分析技术。本文就近几年该技术在人类传染病病毒核酸定量分析方面的研究进行概述。

病毒宏基因组在医学上的应用与未来展望

新型新冠病毒的爆发,给人类安全健康带来了巨大的威胁。在过去的经验中,发现和鉴定新病毒以及确定新病毒与疾病的关系是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务。在过去十几年中,随着高通量测序技术的迅速发展,病毒宏基因组的理论以及技术已被证明在公共卫生,临床病原学诊断等方面发挥着重要的作用。此前,人们对病毒的认识被限制于病毒感染人体进而引起疾病,但是近些年随着人类基因组和微生物组研究表明,病毒与人体之间存在更广泛的相互作用,部分病毒对人体无害,甚至是有益的。本文主要针对近些年来对病毒宏基因组的兴起与发展,研究的策略以及在医学上的一些应用前景进行综述,并提出病毒宏基因组的一些未来展望。

新型多重不对称PCR-电化学芯片法检测甲型流感病毒

目的建立一种基于多重不对称PCR-电化学芯片技术同时检测多种甲型流感病毒的新方法。方法根据常见型甲型流感病毒的基质蛋白(matrix protein,MP)、血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase transferase,NA)基因的保守序列分别设计特异性引物和探针,建立优化多重PCR反应体系,再结合电化学芯片技术建立多重不对称PCR-电化学芯片法检测甲型流感病毒,对所建方法进行特异性和敏感性评价,同时检测200例流感样动物咽拭子样本。结果本方法检测灵敏度可达1×10~3copies/mL,200例动物样本中检出194例阳性,敏感率为97%。结论本研究建立的多重不对称PCR-电化学芯片法可同时检测常见类型甲型流感病毒,具有较高的特异性和灵敏度,且操作较简单、检测周期短,便于临床筛查、诊断和治疗。

造血干细胞研究进展

造血干细胞（HSC）作为一种成体干细胞,是目前研究最深入、发现最早及应用最广泛的干细胞,其具极强的多向分化和自我更新潜能。自20世纪60年代开始,第1例骨骼移植成功以来,干细胞产品种类及应用范围取得突破性进展。到目前为止,已有超过30种干细胞产品进入美国食品药品监督管理局（FDA）审批程序,10余种疾病已入或完成三期临床研究。干细胞技术作为生物领域中重要的组成部分,

Taq DNA聚合酶5′~3′外切活性对荧光定量PCR的影响

目的为探讨Taq DNA聚合酶(后简称Taq酶)中5′~3′外切酶活性在Taqman探针法荧光定量PCR中的作用及影响,指导热启动Taq酶性能改造,本文研究了不同热启动Taq聚合酶的5′~3′DNA外切酶活性差异,以及该活性的高低对Taqman探针法荧光定量PCR的影响。方法使用荧光探针为底物,分别测定不同热启动Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性,对比在相同聚合酶活性下外切酶活性的差异,以及在荧光定量PCR扩增反应中的差异。结果在聚合酶活性相等的条件下,不同的热启动Taq聚合酶具有不同的5′~3′DNA外切酶活性,经化学修饰的Taq酶的5′~3′DNA外切酶活性分别下降2.7倍和4.55倍,经抗体修饰的Taq酶5′~3′DNA外切酶活性没有变化。在乙型肝炎病毒(HBV)DNA荧光定量PCR检测体系中,加入同等聚合酶活性单位的不同修饰方法制备热启动Taq酶,外切酶活性高的酶比活性低的酶ct值更低。结论在Taqman探针法荧光定量PCR反应中,Taq酶对探针的外切降解过程是反应的限速步骤,提高Taq酶5′~3′DNA外切酶活性有利于提高反应效率。

BRCA基因突变型乳腺癌研究进展

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,BRCA基因是乳腺癌最常见的易感基因,与遗传性乳腺癌的发生密切相关,BRCA基因在维护染色体完整性方面具有重要作用。从功能上看,BRCA基因是肿瘤的抑制基因,它的关键区域突变使其抑制功能失去,因而导致肿瘤的发生。目前伴随诊断和靶向治疗是癌症领域研究的热点,BRCA基因突变型为家族性乳腺癌治疗的重要靶点,为其个性化治疗提供了新方向。主要对BRCA基因突变型乳腺癌临床诊断方法及相关治疗进行综述。

乙型肝炎病毒核酸实时荧光PCR超敏检测方法的建立与评价

目的应用Taq?man实时荧光PCR技术,建立一种超敏检测乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)载量的方法(以下简称超敏试剂),并对其临床应用进行评价。方法对比GeneBank中HBV DNA基因组序列,使用Primer 5.0软件在其S区和C区分别设计一对特异性的引物和探针,应用Taq?man探针技术,优化反应体系和反应条件。并收集195例临床样本与某国产试剂进行平行检测,采用相关性分析和Bland?Altman等方法对检测结果进行分析。结果建立的HBV DNA超敏检测方法灵敏度达10 IU/mL,线性范围20~1×10^9 IU/mL,准确性为100%,覆盖型别为A、B、C、D、E、F、H,批内和批间变异系数在5%以内。195例临床样本检测结果显示,与某国产试剂相比,超敏试剂的阳性符合率为99.45%,阴性符合率为91.67%,总符合率为98.97%(Kappa值为0.911 2,P<0.05)。超敏试剂与某国产试剂具有很强的相关性(r=0.979 1,P<0.000 1)。结论本研究成功建立了一种HBV DNA实时荧光PCR检测方法,具有很高的临床应用价值。

基于Taqman荧光ARMS-PCR技术检测CYP3A5基因多态性方法的建立

目的建立一种基于Taqman荧光的ARMS-PCR技术检测人外周全血样本CYP3A5*3(rs776746)基因多态性的新方法。方法根据CYP3A5和内参基因的保守序列分别设计特异性引物及探针,建立CYP3A5*1和CYP3A5*3 Taqman荧光ARMS-PCR检测体系及其测序体系,并对200例人外周全血样本进行检测及金标准测序对比验证,分析2种检测方法的一致性,并统计分析CYP3A5*3基因多态性的分布。结果该方法可检测人外周全血样本CYP3A5*3(rs776746)基因多态性,其检测结果与sanger测序一致性为100%。200例外周血样本CYP3A5*3基因型分布:*1/*1型19例(9.5%),*1/*3型为62例(31.0%),*3/*3型为119例(59.5%)。结论本研究建立的基于Taqman荧光ARMS-PCR技术的检测方法能够简单、快速、准确地检测CYP3A5*3基因型,适用于临床推广。

基于ARMS-qPCR技术检测 SLC25A13基因c.2T>C突变方法的建立及临床验证

建立一种基于荧光定量PCR的扩增阻滞突变系统方法(amplification-refractory mutation system quantitative real-time PCR,ARMS-qPCR)检测 SLC25A13基因c.2T>C突变并验证其诊断性能。根据ARMS-qPCR引物设计原则,针对 SLC25A13的保守序列设计特异性引物,利用人工合成纯合突变型质粒及200份已测序验证的人外周血核酸样本建立 SLC25A13基因c.2T>C突变ARMS-qPCR检测体系及其Sanger测序体系,并应用提取自另外其他200份人外周血的核酸样本验证此体系的诊断效能,所获结果与作为金标准的Sanger测序结果对比,分析2种检测方法的一致性。结果显示,本研究建立的ARMS-qPCR体系可准确区分 SLC25A13基因野生型及携带c.2T>C突变型;利用该方法检测人外周血中 SLC25A13 c.2T>C突变状态,其检测结果与Sanger测序结果一致性为100%。200份外周血样本中,携带 SLC25A13基因c.2T>C突变8份(4%),非携带者192份(96%)。综上,本研究建立的ARMS-qPCR测试能够快速、准确地检测 SLC25A13基因c.2T>C突变,有助于希特林蛋白缺陷病(citrin deficiency,CD)的诊断。

感染性疾病mNGS检测结果解读的应用

由于技术的快速发展和成本的大幅降低,宏基因组下一代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)的应用正在从研究转向临床实验室。尽管许多研究和病例报告已经证实mNGS在改进传染病的预防、诊断、治疗和追踪方面取得了成功,但仍有一些障碍必须克服。mNGS的结果会展示样本中的全部可能病原体,然而面对着数千种会感染人类的微生物,如何准确判读其中关键致病病原体是具有挑战性的。迄今为止,在临床实践中,mNGS的解读标准也尚未统一。本文就mNGS在不同系统中病原体感染的结果解读,mNGS结果的临床解读和应用规则,以及mNGS解读在病原体诊断中面临的挑战进行阐述。

广东地区新型冠状病毒实验室检测专家共识(全文)

新型冠状病毒肺炎全球蔓延,其发病隐袭,传染性强,重症患者病死率高,且无特效药物,对全球公共卫生构成巨大威胁。为此,中国迅速建立了一系列预防控制和医疗救治措施,并获得了抗击疫情的阶段性胜利,而快速精准的实验室检测在此过程中发挥着至关重要的作用。本共识由广东省内病毒学、临床检验、临床医学、预防医学等专业领域的专家总结国内外新型冠状病毒实验室检测技术研究现状,结合广东省一线防治及检测经验修改而成,适用于一线实验室检验人员及临床医师。

生物标记物与精准医疗研究进展

自2015年精准医疗理念提出后,生物标记物与精准医疗愈加被人们重视。并被广泛应用于病毒、癌症等重大疾病的筛查与治疗研究中。新兴循环生物标记物的应用与开发,在HBV、HPV的检测和肿瘤的靶向药物治疗、细胞治疗、免疫抑制剂、癌症疫苗开发方向上都取得了重大成果。与传统的医疗方法相比,生物标记物为辅助精准医疗的检测治疗模式,无论是在研发还是治疗上都有着显著的优势。因此,综述了生物标记物与精准医疗的应用,并就最近的研究报告重点综述了生物标记物与精准医疗的最新研究进展。

基于下一代测序的基因融合检测技术在肿瘤伴随诊断中的研究进展

基因融合是促肿瘤发展的基因组机制之一,也是影响患者预后不良的重要原因。基因融合的检测对于肿瘤生物标志物的识别、癌症亚型分类以及最终的临床用药指导至关重要,适宜的方法有助于肿瘤早期诊断及避免无效用药。传统的检测方法包括荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、免疫组化(immunohistochemical,IHC)、逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)以及下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)。下一代测序主要有全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)、转录组测序(whole transcriptome sequencing,WTS)和目标区域测序(杂交捕获法/扩增子法)等技术。在临床伴随诊断的应用中,检测方法的选择需要综合考虑可操作性、时间和费用以及数据分析所需的专业知识水平等因素。本文综合阐述针对基因融合的不同检测方法、技术原理以及各自优点和局限性,为基因融合检测方法的选择提供参考依据。

基于NGS的宏基因组学在微生物病原体鉴定中的应用

病原微生物广泛存在于自然环境,常对人类和动物的健康带来极大的伤害。传统病原微生物的鉴定方法主要基于微生物纯化培养和分离,但绝大多数微生物为非培养微生物,而目前应用较为广泛的免疫学方法和PCR技术等每次检测样品数量少且只能检测已知病原体。宏基因组学技术以某特定环境中的微生物群体为研究对象,在非培养型微生物的鉴定中极具优势。下一代测序技术(NGS)的迅速发展极大的促进了宏基因组学的发展及应用,使得该技术迅速而又广泛的应用于各种环境微生物的研究中,并已渗透到医药、农业、生物技术等多个领域。宏基因组学在微生物病原体鉴定研究方面具有巨大的潜力和优势,本文就近几年基于NGS的宏基因组学在病原微生物鉴定相关研究进行概述。

HIV-1基因PR区和RT区基因耐药突变检测之PCR-测序法的建立与评价

目的应用巢式PCR和Sanger测序技术,建立一种人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 pol基因蛋白酶(PR)区及逆转录酶(RT)区耐药突变检测的方法。方法根据HIV-1 pol基因保守区域设计特异性的2对扩增引物和6条测序引物,使用巢式PCR特异性扩增HIV-1 PR区以及RT区耐药突变基因序列,进而对靶标基因区域进行双向Sanger测序检测,实现了HIV-1基因PR区和RT区基因耐药突变检测的高灵敏性、特异性、准确性。结果本研究所建立的针对HIV-1 pol基因PR区和RT区耐药突变的检测方法,巢式PCR结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定有清晰、单一条带,符合扩增产物大小,其Sanger测序检测的HIV-1 PR区以及RT区耐药突变基因序列分析结果与HIV-1耐药性分析国家参考品一致。灵敏度:1×10^(3)copies/mL浓度的标准品重复测20次,检出率为100%;突变率检测:20%突变率的样本20个重复检测均100%为突变型;特异性验证:检测HBV、HCV、EBV血清样本,均为阴性。结论本研究建立的以巢式PCR和Sanger测序相结合的检测方法,具有灵敏度高、准确性高、结果可靠等优点,适用于HIV-1pol基因PR区以及RT区耐药突变的体外检测。