拟南芥抗病相关基因T1N6_22的原核表达分析

为构建拟南芥抗病相关T1N6_22基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的T1N6_22蛋白,以拟南芥Col-0的c DNA为模板,扩增获得了T1N6_22基因CDS,对其进行克隆、测序后与含有GST标签蛋白的p GEX4T-1载体相连,构建T1N6_22的原核表达载体p GEX4T-1-T1N6_22-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的载体及空载体转化大肠杆菌BL21。结果表明,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的T1N6_22蛋白,大小约57 k Da。SDS-PAGE分析表明,高效表达的诱导条件为0.1 mmol/L IPTG诱导培养3 h。研究结果为进一步T1N6_22互作蛋白的筛选及其调控拟南芥抗病分子机制的研究奠定了基础。

AP22.65基因调控拟南芥开花的机制分析

为揭示AP22.65基因在拟南芥开花过程中的调控机制,对AP22.65基因与拟南芥开花调控途径的关系进行了分析,发现拟南芥ap22.65突变体中赤霉素途径基因SPY,光周期途径基因GI、CO和FT,春化途径基因VNR2、VIN4和FLC,整合途径基因LFY、TFL1和EMF1的表达水平均明显下调,FVE、CCA1、VNR1和SOC1表达变化不明显。CO超表达突变体WT/CO和spy、gi、lhy突变体中AP22.65基因的表达水平均不同程度上调,而FLC超表达突变体WT/FLC中AP22.65基因的表达水平明显下调。春化处理后,ap22.65、回复及超表达突变体的花期和AP22.65基因的表达变化不明显;赤霉素处理后,ap22.65突变体的花期明显延迟,且AP22.65基因的表达明显增强,明确AP22.65基因主要参与光周期途径和赤霉素途径调控拟南芥开花。

拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子At MYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明At MYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子At MYB73的酵母诱饵表达载体p AS1-At MYB73,检测p AS1-At MYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆At MYB73的N端区域(含有R2R3结构域)和C端区域(不含R2R3结构域),检测At MYB73的N端和C端的转录激活活性,分析At MYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以At MYB73为诱饵筛选拟南芥的c DNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选获得的At MYB73的候选互作蛋白进行分析。构建At MYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体p GBDT7-At MYB73和p GADT7-F12F1.4,通过酵母双杂交技术,对其互作关系进行分析。【结果】含p AS1-MYB73的酵母菌在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp/、SD/-Ade/-Trp培养基上均能生长,表明At MYB73具有较高的自激活活性。含p AS1-At MYB73的酵母菌在SD/-Trp/Amp液体培养基中培养24 h的OD600值大于0.8,表明诱饵载体对酵母Y190没有细胞毒性。成功构建了p AS1-At MYB73-N和p AS1-At MYB73-C载体,获得了含有p AS1-At MYB73-N和p AS1-At MYB73-C的酵母;含p AS1-At MYB73-N的酵母在含X-a-gal的YPAD培养基上呈现无色,而含p AS1-At MYB73-C的酵母则呈现蓝色,表明At MYB73的C端有明显的自激活性,而N端没有自激活性。以At MYB73为诱饵,筛选拟南芥的c DNA文库,获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个蛋白。利用酵母双杂交技术,确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定的互作。【结论】拟南芥抗逆转录因子At MYB73具有较高的转录激活活性,其活性区域位于C端;以At MYB73为诱饵,筛选获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个At MYB73的候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术,确定了At MYB73与F12F1.4之间的互作关系。

拟南芥R2R3-MYB家族第22亚族的结构与功能

拟南芥R2R3-MYB转录因子在拟南芥生长发育、代谢及响应生物和非生物胁迫的调控网络中具有重要作用。根据保守的氨基酸序列,R2R3-MYB转录因子被分为25个亚族,其中第22亚族包含AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70 4个基因,主要响应生物和非生物胁迫。文章从基因功能的相似性、基因表达的一致性和基因结构的保守性3方面综述了第22亚族的4个基因,并综合讨论了其在结构与功能上的冗余性和多样性。