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关于市政给排水施工中的非开挖顶管施工技术
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作者 蒋红亮 《中文科技期刊数据库(引文版)工程技术》 2024年第6期0123-0126,共4页
本文以某高新区的污水管网工程为例,简要分析市政给排水施工中的非开挖顶管施工技术要点,并以加强非开挖顶管施工技术在市政给排水施工中的应用措施作为切入点,对建立完善的质量管理体系、建立施工监测系统、做好工程前期调查和设计、... 本文以某高新区的污水管网工程为例,简要分析市政给排水施工中的非开挖顶管施工技术要点,并以加强非开挖顶管施工技术在市政给排水施工中的应用措施作为切入点,对建立完善的质量管理体系、建立施工监测系统、做好工程前期调查和设计、加强技术研究与创新以及积极开展培训工作等方面进行研究,期望能够为相关人员提供参考。 展开更多
关键词 市政工程 排水施工 非开挖 顶管施工技术
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分子伴侣CsaA过表达及wprA蛋白酶的缺失对枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白的影响 被引量:2
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作者 蒋红亮 张虹 +1 位作者 赵辅昆 丁明 《浙江理工大学学报(自然科学版)》 2011年第2期260-266,共7页
在枯草芽孢杆菌B.subtilis168菌株,以及在其改造菌株B.subtilis168wprA-和B.subtilis168/wprA::csaA中表达来自碱性芽孢杆菌C-125的碱性果胶酶和来自巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶。碱性果胶酶在B.subtilis中分泌表达时,敲除了wprA蛋白酶... 在枯草芽孢杆菌B.subtilis168菌株,以及在其改造菌株B.subtilis168wprA-和B.subtilis168/wprA::csaA中表达来自碱性芽孢杆菌C-125的碱性果胶酶和来自巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶。碱性果胶酶在B.subtilis中分泌表达时,敲除了wprA蛋白酶基因的B.subtilis168wprA-菌株相对于其野生型菌株B.subtilis168分泌表达的总的酶活力下降了36%,再次整合csaA进wprA位点后的B.subtilis168/wprA::csaA菌株,其表达量又恢复到相当于野生型菌株的表达水平。青霉素酰化酶在B.subtilis168wprA-菌株中的表达与野生型相比没有明显差异;而整合csaA分子伴侣进wprA位点后的菌株(B.subtilis168/wprA::csaA),相对于野生型其总的酶活力高出66%,说明分子伴侣CsaA数量的增加可以明显提高酶的表达量,并显示出普遍提高蛋白总活力的作用,而蛋白酶wprA基因的敲除,对某些蛋白的表达量能够产生明显的影响,在提高表达的稳定性方面表现出普遍的促进作用。本实验表达的青霉素酰化酶酶活力(14.7 U/mL)比工业应用中的酶活力(10 U/mL)高出了47%。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 分子伴侣CsaA 蛋白酶wprA
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超声波萃取法测定茶叶中有机磷类的农药残留方法 被引量:18
3
作者 杜晓刚 杨扬 +2 位作者 金凤明 蒋红亮 庄伟 《江苏工业学院学报》 2005年第2期20-22,共3页
将超声提取技术用于检测茶叶中的农药残留,建立了火焰光度检测器气相色谱法定量测定茶叶中有机磷农药残留的分析方法。实验表明:3个不同水平的标准添加,其回收率范围甲胺磷为75 2%~95 3%、乐果为86 7%~110 2%;相对标准偏差为4 8%和3 ... 将超声提取技术用于检测茶叶中的农药残留,建立了火焰光度检测器气相色谱法定量测定茶叶中有机磷农药残留的分析方法。实验表明:3个不同水平的标准添加,其回收率范围甲胺磷为75 2%~95 3%、乐果为86 7%~110 2%;相对标准偏差为4 8%和3 5%;检出限为0 01mg/kg和0 02mg/kg。该方法具有速度快、灵敏度高、重现性好等特点。 展开更多
关键词 超声波 气相色谱 茶叶 农药残留
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基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素对血管内皮细胞的影响 被引量:1
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作者 蒋红亮 武秀华 刘国锋 《交通医学》 2010年第4期364-368,共5页
目的:研究肺癌A549细胞体外转染重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因后,其产物对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养肺癌A549细胞,分为3组:实验组、缺陷型腺病毒组、PBS组。以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入... 目的:研究肺癌A549细胞体外转染重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因后,其产物对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养肺癌A549细胞,分为3组:实验组、缺陷型腺病毒组、PBS组。以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入体外培养的肺癌A549细胞,ELISA检测外源基因内皮抑素,在体外培养的肺癌A549细胞中的表达。体外培养血管内皮细胞,以MTT法评价重组血管内皮抑素基因腺病毒(Ad.Endostatin)转染肺癌细胞后含内皮抑素的上清液对内皮细胞增殖的抑制作用。结果:ELISA检测结果:重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在转染的肺癌A549细胞中高效表达,在转染肺癌细胞后第1天即有内皮抑素的表达,在第3天达到高峰,5~7天后逐渐减弱。缺陷型腺病毒组及PBS组未见有表达。MTT检测结果:Ad.Endostatin转染肺癌A549细胞后表达的内皮抑素可抑制体外培养的血管内皮细胞的增殖,而缺陷型腺病毒组及PBS组对血管内皮细胞的增殖未见有抑制作用。结论:腺病毒介导的血管内皮抑素基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素,能很好抑制血管内皮细胞的生长和增殖,为进一步开展肺癌基因治疗打下基础。 展开更多
关键词 肺癌细胞 内皮抑素 血管内皮细胞 腺病毒
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含气量对空泡脉动特性影响的理论研究
5
作者 蒋红亮 徐荣青 《光学与光电技术》 2010年第3期25-28,共4页
分析了含气量对粘性液体中球形单空泡脉动特性的影响。研究结果表明:随着泡内初始含气量的增加,空泡达到最大泡半径的时间延长;空泡膨胀的最大泡半径、收缩的最小泡半径和脉动周期均随初始含气量的增加而增加;同时,空泡膨胀和溃灭时泡... 分析了含气量对粘性液体中球形单空泡脉动特性的影响。研究结果表明:随着泡内初始含气量的增加,空泡达到最大泡半径的时间延长;空泡膨胀的最大泡半径、收缩的最小泡半径和脉动周期均随初始含气量的增加而增加;同时,空泡膨胀和溃灭时泡壁的运动速度均随空泡初始含气量的变化而变化。无论含气量如何,在空泡收缩到最小泡半径附近,泡壁运动速度(收缩或膨胀)要明显快于其在最大泡半径附近;此外,受液体粘性影响,空泡膨胀和收缩过程明显变缓。 展开更多
关键词 空泡 含气量 粘性 脉动
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基于FTA和蒙特卡罗的双极HDVC系统可靠性评估
6
作者 谭忠富 蒋红亮 《科技创新与应用》 2012年第11Z期37-38,共2页
电力系统的可靠性是评估电力生产的重要手段,而HVDC系统可靠性指标已成为评估电力系统可靠性的重要指标。本文首先分析了导致HVDC系统失效的原因,并在此基础上建立了故障树、确定了最小割集,然后通过蒙特卡罗仿真诊断出HVDC双极失效的... 电力系统的可靠性是评估电力生产的重要手段,而HVDC系统可靠性指标已成为评估电力系统可靠性的重要指标。本文首先分析了导致HVDC系统失效的原因,并在此基础上建立了故障树、确定了最小割集,然后通过蒙特卡罗仿真诊断出HVDC双极失效的关键因素和关键失效模式并在此基础上提出了改进措施,为研究和解决HVDC系统可靠性问题提供了新的思路。 展开更多
关键词 可靠性 HVDC 故障树 蒙特卡罗
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试论管理者事业成功中的科学决策问题
7
作者 蒋红亮 《中小企业管理与科技》 2010年第36期37-38,共2页
决策是各级各类管理者最基本的职责。而能否进行科学有效的决策,则是管理者取得事业上成功的根本保证。为此,本文从问题、权限和时机三个方面谈谈科学决策问题。
关键词 科学决策 管理者 事业成功
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一种改进的启发式P圈构造算法 被引量:1
8
作者 甘宝宝 蒋红亮 +1 位作者 孙晓寅 徐荣青 《计算机应用研究》 CSCD 北大核心 2009年第9期3219-3221,共3页
原有启发式P圈构造算法Grow没有考虑到在对基本圈上的一条边扩张时可能会抑制其他边的扩张,从而失去一些先验效率较高的P圈。针对这一缺点对Grow算法进行了改进。改进后的算法根据所有的圈上边扩张后得到的P圈先验效率的高低顺序,优先... 原有启发式P圈构造算法Grow没有考虑到在对基本圈上的一条边扩张时可能会抑制其他边的扩张,从而失去一些先验效率较高的P圈。针对这一缺点对Grow算法进行了改进。改进后的算法根据所有的圈上边扩张后得到的P圈先验效率的高低顺序,优先选择引入的P圈具有最高先验效率的边进行扩张,因此每次扩张都最大可能地提高P圈的先验效率,而且P圈平均跳数基本不变。仿真结果表明,此算法可以在减少备选P圈数量的同时,提高网络的资源利用率。 展开更多
关键词 光网络 保护 生存性 预置圈
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一种新的启发式P圈容量分配算法 被引量:1
9
作者 甘宝宝 徐荣青 +1 位作者 蒋红亮 孙小寅 《光通信研究》 北大核心 2009年第5期1-3,7,共4页
文章针对以往启发式P圈容量分配算法资源利用率低和分配不均衡的问题,提出了一种新的启发式算法,该算法首先根据网络拓扑和未保护的工作容量构造一组备选圈,然后再选出保护效率最大的圈分配到网络中。该算法的特点是将未保护的工作容量... 文章针对以往启发式P圈容量分配算法资源利用率低和分配不均衡的问题,提出了一种新的启发式算法,该算法首先根据网络拓扑和未保护的工作容量构造一组备选圈,然后再选出保护效率最大的圈分配到网络中。该算法的特点是将未保护的工作容量作为构造备选圈的关键因素之一。仿真结果表明,新算法比以往启发式算法具有更好的资源利用率,同时资源分配更均衡。 展开更多
关键词 光网络 保护 生存性 预置圈
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醛糖还原酶cDNA的克隆和表达
10
作者 项军强 蒋红亮 +2 位作者 张虹 丁明 赵辅昆 《浙江理工大学学报(自然科学版)》 2011年第2期251-255,共5页
醛糖还原酶能促使葡萄糖转化成山梨醇,是多元醇代谢通路的限速酶,与糖尿病并发症的发生和发展有密切关系。用RT-PCR扩增醛糖还原酶基因,将扩增产物克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b(+)-AR。经PCR、双酶切和序列... 醛糖还原酶能促使葡萄糖转化成山梨醇,是多元醇代谢通路的限速酶,与糖尿病并发症的发生和发展有密切关系。用RT-PCR扩增醛糖还原酶基因,将扩增产物克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b(+)-AR。经PCR、双酶切和序列测定鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定后,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得重组蛋白AR-(His)6。紫外分光光度法对AR-(His)6进行酶活检测,其比活力为0.45 U/mg,为下一步筛选具有抑制醛糖还原酶活性的化合物及开发有临床应用价值的醛糖还原酶抑制剂提供参考。 展开更多
关键词 糖尿病并发症 醛糖还原酶 表达纯化
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高表达PGA的枯草芽孢杆菌蛋白质组学研究
11
作者 张虹 蒋红亮 +1 位作者 赵辅昆 丁明 《浙江理工大学学报(自然科学版)》 2011年第1期116-121,共6页
为了解外源蛋白高表达时枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统胞内蛋白质组的变化,实验建立了青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase,PGA)高表达B.subtilis系统,可达到1.6 g/L的表达量以及10 U/mL的酶活;通过双向电泳技术(2-DE)分离PG... 为了解外源蛋白高表达时枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统胞内蛋白质组的变化,实验建立了青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase,PGA)高表达B.subtilis系统,可达到1.6 g/L的表达量以及10 U/mL的酶活;通过双向电泳技术(2-DE)分离PGA高表达以及低表达重组菌中胞内蛋白,软件分析结果显示,两者胞内蛋白表达差异极大;通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定出其中6个差异蛋白,其中4个与PGA高表达抑制菌体生长相关,而PhoR和YxiE则与PGA高表达分泌胁迫机制有关。 展开更多
关键词 PGA MALDI-TOF-TOF 双向电泳 蛋白质组
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基于深度学习的视频预测研究综述 被引量:28
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作者 莫凌飞 蒋红亮 李煊鹏 《智能系统学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期85-96,共12页
近年来,深度学习算法在众多有监督学习问题上取得了卓越的成果,其在精度、效率和智能化等方面的性能远超传统机器学习算法,部分甚至超越了人类水平。当前,深度学习研究者的研究兴趣逐渐从监督学习转移到强化学习、半监督学习以及无监督... 近年来,深度学习算法在众多有监督学习问题上取得了卓越的成果,其在精度、效率和智能化等方面的性能远超传统机器学习算法,部分甚至超越了人类水平。当前,深度学习研究者的研究兴趣逐渐从监督学习转移到强化学习、半监督学习以及无监督学习领域。视频预测算法,因其可以利用海量无标注自然数据去学习视频的内在表征,且在机器人决策、无人驾驶和视频理解等领域具有广泛的应用价值,近两年来得到快速发展。本文论述了视频预测算法的发展背景和深度学习的发展历史,简要介绍了人体动作、物体运动和移动轨迹的预测,重点介绍了基于深度学习的视频预测的主流方法和模型,最后总结了当前该领域存在的问题和发展前景。 展开更多
关键词 视频预测 深度学习 无监督学习 运动预测 动作识别 卷积神经网络 递归神经网络 自编码器
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基于改进证据理论融合的站域后备保护算法 被引量:11
13
作者 蒋红亮 吕飞鹏 《电力系统保护与控制》 EI CSCD 北大核心 2018年第12期57-63,共7页
针对站域后备保护(SABP)信息同步性要求高和容错性低等问题,提出了一种基于改进证据理论融合的SABP算法。首先,SABP装置根据全站各线路两端传统主/后备保护和方向元件动作情况识别疑似故障线路,并由各疑似故障线路两端保护信息构成证据... 针对站域后备保护(SABP)信息同步性要求高和容错性低等问题,提出了一种基于改进证据理论融合的SABP算法。首先,SABP装置根据全站各线路两端传统主/后备保护和方向元件动作情况识别疑似故障线路,并由各疑似故障线路两端保护信息构成证据融合信息域。然后,搜集证据融合信息域内的主/后备保护和方向元件动作信息,经预处理后形成证据组并计算各证据的基本概率赋值,利用改进证据理论对证据信息进行融合判断来实现故障线路的识别。算例仿真表明,该SABP算法具有无需信息同步、站域信息交互的通信量小和信息容错性高等特点,能有效改善SABP性能。 展开更多
关键词 站域后备保护 故障识别 信息融合 D-S证据理论
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基于相对熵组合赋权法的继电保护定值在线校核顺序研究 被引量:12
14
作者 蒋红亮 吕飞鹏 《电测与仪表》 北大核心 2018年第6期82-88,共7页
为了使继电保护定值在线校核更高效合理,提出了按照保护综合重要度对继电保护定值进行顺序校核。针对现有保护重要度评估中存在评估角度单一的问题,文中综合保护所处网络位置关键程度和保护故障后果严重程度2个角度,构建了保护综合重要... 为了使继电保护定值在线校核更高效合理,提出了按照保护综合重要度对继电保护定值进行顺序校核。针对现有保护重要度评估中存在评估角度单一的问题,文中综合保护所处网络位置关键程度和保护故障后果严重程度2个角度,构建了保护综合重要度评估模型。首先利用支路有功潮流介数,提出支路重要度指标,以量化评估保护所处支路的关键程度;然后利用保护事故链模型结合风险理论提出保护故障严重度指标,以量化评估保护故障连锁的风险后果;最后提出保护配合度指标,以量化评价保护所处位置的拓扑结构脆弱性。为弥补单一赋权法的局限性,通过相对熵组合赋权法求出各指标权重,进而得到保护综合重要度指标,并以综合重要度排序进行保护定值在线顺序校核。与已有的方法比较,该方法更为全面地评估了保护的重要度,以此确定的保护定值校核顺序更具参考意义。仿真算例验证了该方法的正确性、全面性。 展开更多
关键词 继电保护 在线校核 相对熵 组合评价法 保护综合重要度
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基于差分等势星球图的通信辐射源个体识别方法 被引量:2
15
作者 蒋红亮 王申华 +3 位作者 赵凯美 应雨龙 李靖超 何湘威 《济南大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2021年第5期433-438,451,共7页
为了准确地识别和认证物联对象,阻止用户身份假冒和设备克隆等问题的发生,提出一种基于差分等势星球图的通信辐射源个体识别方法;通过差分等势高星球图的射频指纹特征提取,在不对接收机的载波频率偏差和相位偏差进行估计和补偿的情况下... 为了准确地识别和认证物联对象,阻止用户身份假冒和设备克隆等问题的发生,提出一种基于差分等势星球图的通信辐射源个体识别方法;通过差分等势高星球图的射频指纹特征提取,在不对接收机的载波频率偏差和相位偏差进行估计和补偿的情况下,获取较稳定的通信辐射源个体(发射机)射频指纹;对同厂家、同型号、同批次的20个无线保真网卡设备进行识别测试。结果表明:差分等势星球图通过点密度特征可以恢复一定低信噪比时的星座图丢失的统计特征,更全面地描述信号的细微特征;在相同的深度卷积神经网络模型架构下,相较于传统的基于星座图的统计图域方法,所提出的方法可以在很大程度上提高识别准确率。 展开更多
关键词 物联网 射频指纹 星座图 差分等势星球图
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基于图论的智能变电站站域后备保护跳闸策略 被引量:3
16
作者 蒋红亮 吕飞鹏 《电气技术》 2017年第12期24-29,37,共7页
目前对站域后备保护算法研究已有一定的进展,但对相应跳闸策略研究还比较缺乏。针对这一空白,本文提出了一种基于图论知识的站域后备保护跳闸策略。根据智能变电站拓扑结构、站间连接关系及断路器状态信息,形成实时站内元件-开关关联矩... 目前对站域后备保护算法研究已有一定的进展,但对相应跳闸策略研究还比较缺乏。针对这一空白,本文提出了一种基于图论知识的站域后备保护跳闸策略。根据智能变电站拓扑结构、站间连接关系及断路器状态信息,形成实时站内元件-开关关联矩阵和站间元件-开关关联矩阵,然后结合故障元件和失灵断路器的具体情况建立站域元件-开关关联向量,并通过关联向量识别出站域后备保护在实现近后备保护功能和断路器失灵保护功能时所关联的断路器。算例分析表明,所提方法可适用于主接线形式复杂和运行方式变化的智能变电站,能实现自适应最小范围快速切除故障。 展开更多
关键词 智能变电站 继电保护 站域后备保护 图论 跳闸策略
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一种基于5G通信的配电网差动保护算法 被引量:7
17
作者 林军 韦恬静 +4 位作者 蒋红亮 王申华 曹俊 李昊 刘晓莉 《电力信息与通信技术》 2021年第10期20-29,共10页
5G通信具有高可靠和低时延的特点,为配电网差动保护的通信通道选择提供了新的可能。然而,由于5G通信端到端的传输时延抖动较大,目前仍难以满足传统电流差动保护算法的要求。为解决5G通信技术端到端的传输时延抖动影响电流差动保护可靠... 5G通信具有高可靠和低时延的特点,为配电网差动保护的通信通道选择提供了新的可能。然而,由于5G通信端到端的传输时延抖动较大,目前仍难以满足传统电流差动保护算法的要求。为解决5G通信技术端到端的传输时延抖动影响电流差动保护可靠性的问题,文章提出了基于相关系数算法的电流差动保护判据,在不同的故障条件、平均传输时延和时延抖动范围下验证了所提算法的有效性,并给出了其适用范围。 展开更多
关键词 5G 电流差动保护 时延抖动 相关系数
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腺病毒介导血管内皮抑素基因转染肺癌细胞后的表达
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作者 蒋红亮 黄利荣 +1 位作者 武秀华 蔡平 《交通医学》 2007年第4期358-359,363,共3页
目的:观察重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在体外转染A549细胞后的表达。方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入肺癌A549细胞,以免疫组织化学法、Western印迹法和ELISA法检测内皮抑素在A549细胞中的表达。结果:... 目的:观察重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在体外转染A549细胞后的表达。方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入肺癌A549细胞,以免疫组织化学法、Western印迹法和ELISA法检测内皮抑素在A549细胞中的表达。结果:免疫组化染色、ELISA法和Western印迹法检测:A549细胞中内皮抑素蛋白表达阳性,Ad.Null组及PBS组内皮抑素蛋白未见有表达。结论:Ad.Endostatin转染A549细胞可表达具有生物学活性的内皮抑素。 展开更多
关键词 内皮抑素 基因表达 重组腺病毒 肺癌细胞
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基于保护综合重要度的最小断点集优选方法 被引量:2
19
作者 蒋红亮 《电气技术》 2019年第10期41-45,57,共6页
为实现复杂环网整定配合起始点的合理选择,本文提出了一种基于保护综合重要度的最小断点集优选方法。首先,定义了反映保护所处位置电气耦合程度的保护配合度指标;其次,基于保护事故链模型并结合风险理论,进而得到保护风险脆弱度指标;然... 为实现复杂环网整定配合起始点的合理选择,本文提出了一种基于保护综合重要度的最小断点集优选方法。首先,定义了反映保护所处位置电气耦合程度的保护配合度指标;其次,基于保护事故链模型并结合风险理论,进而得到保护风险脆弱度指标;然后,结合线路电气介数和节点电气介数得出了保护结构重要度指标;最后,运用层次分析法确定各指标权重,构建了多层次多角度的保护重要度评价模型,并跟据保护综合重要度指标给出了一种最小断点集优选问题的解决方法。与已有的方法比较,本文所提出的方法较为全面地评估了保护重要度,以此确定的最小断点集具有参考意义。本文通过算例验证了该方法的全面性和有效性。 展开更多
关键词 继电保护 整定计算 最小断点集 保护综合重要度 层次分析法
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应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白 被引量:3
20
作者 原贵波 莫双榕 +5 位作者 钱莹 臧栋楠 杨帆 蒋红亮 武媛 丁海东 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第15期3146-3157,共12页
【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的“FxxhVQxhTG”氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进... 【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的“FxxhVQxhTG”氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白(空GST为阴性对照),利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B(RACK1B),通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。 展开更多
关键词 番茄 SlVQ6 SlMPK1 pull-down 互作蛋白
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