SHP2过表达抑制人肝星状细胞LX-2凋亡

目的探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)过表达对人肝星状细胞LX-2凋亡的影响。方法将表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2转染LX-2细胞。实验分为3组:(1)Control组,以DMEM代替腺病毒转染LX-2细胞;(2)Ad-GFP组,转染空病毒Ad-GFP;(3)Ad-SHP2组,转染重组腺病毒Ad-SHP2。Western blotting检测3组LX-2细胞的SHP2、Bax、Bcl-2蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测3组LX-2细胞的SHP2 mRNA表达;TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测3组LX-2细胞凋亡情况。结果Ad-SHP2组LX-2细胞的SHP2蛋白及mRNA相对表达量高于Control组及Ad-GFP组(P<0.05);Ad-GFP组与Control组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测结果显示,与Control组LX-2细胞凋亡率(3.08±0.73)%、(9.44±0.80)%及Ad-GFP组(3.25±0.85)%、(8.89±1.98)%比较,Ad-SHP2组(1.52±0.26)%、(2.44±0.93)%降低(P<0.05);Ad-GFP组与Control组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组LX-2细胞的Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05);Ad-SHP2组LX-2细胞的Bax蛋白相对表达量(1.55±0.21)低于Control组(1.99±0.15)及Ad-GFP组(2.00±0.16)(P<0.05);而Bcl-2蛋白相对表达量(2.13±0.25)则高于Control组(1.71±0.15)及Ad-GFP组(1.52±0.14)(P<0.05);但Ad-GFP组与Control组Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论SHP2过表达通过升高Bcl-2/Bax抑制体外人肝星状细胞LX-2凋亡。

SHP2表达变化对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织中Akt表达的影响

目的 探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)过表达及低表达对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠肝组织中蛋白激酶B(Akt)的影响。方法选取160只健康雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组、AdGFP组、Ad-SHP2组和Ad-shRNA/SHP2组,每组32只。采用腹腔注射CCl4法构建大鼠肝纤维化模型,经大鼠尾静脉分别将表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2、表达GFP并携带靶向SHP2的短发夹RNA(shRNA)的腺病毒Ad-shRNA/SHP2注入大鼠体内。各组分别于造模第2、4、6、8周随机选取8只大鼠,留取肝组织标本。采用实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝组织中SHP2、Akt的mRNA表达水平,采用蛋白质印迹法检测各组大鼠肝组织中SHP2、Akt及磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达水平,采用H-E染色法观察各组大鼠肝组织的病理变化,采用Masson三色染色法观察各组大鼠肝组织的胶原沉积情况。结果 靶向SHP2的shRNA及外源性野生型SHP2基因成功导入肝纤维化大鼠体内,并使大鼠肝组织中SHP2呈低表达或过表达。与模型组及Ad-GFP组比较,Ad-SHP2组大鼠的肝纤维化程度加重,而Ad-shRNA/SHP2组大鼠的肝纤维化程度则减轻。在同一造模时间点(第2、4、6、8周)对各组大鼠肝组织中Akt的m RNA和蛋白表达水平,以及p-Akt蛋白表达水平进行比较,结果显示Ad-GFP组、Ad-SHP2组、Ad-shRNA/SHP2组及模型组均显著高于对照组(P均<0.05),而各时间点的Ad-GFP组、Ad-SHP2组、Ad-shRNA/SHP2组及模型组的Akt表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05);与模型组及Ad-GFP组大鼠肝组织中p-Akt表达水平相比较,AdshRNA/SHP2组在各时间点均显著降低(P均<0.05),Ad-SHP2组在各时间点均显著升高(P均<0.05),模型组与Ad-GFP组的p-Akt表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 在CCl4诱导的大鼠肝纤维化病程中,肝组织中SHP2过表达可通过促进Akt磷酸化增强Akt的活性,而肝组织中SHP2低表达则可通过抑制Akt磷酸化减弱Akt的活性。

含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2表达变化对肝纤维化大鼠肝组织中细胞外信号调节激酶1/2活性的影响

目的:探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)表达变化对肝纤维化大鼠肝组织中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)活性的影响。方法:健康雄性SD大鼠160只被随机分为五组(对照组、模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP组),每组32只。除对照组(腹腔注射0.9%氯化钠溶液)外,其余四组构建四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型,并将表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2、表达GFP及靶向SHP2的短发夹RNA(shRNA)的腺病毒Ad-shRNA/SHP自大鼠尾静脉分别注射入Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组大鼠,各组分别于造模第2、4、6、8周选取8只大鼠留取肝组织标本。采用HE染色观察大鼠肝组织病理学变化;采用Masson三色染色检测大鼠肝组织胶原沉积;采用实时荧光定量PCR检测大鼠肝组织SHP2、ERK1 mRNA表达;采用免疫组织化学染色检测SHP2蛋白表达;采用Western blot检测ERK1和p-ERK1蛋白表达。结果:大鼠肝纤维化模型成功构建,在各造模时间点,与模型组及Ad-GFP组大鼠肝组织胶原沉积比较,Ad-SHP2组均加重,而Ad-shRNA/SHP2组均减轻。导入野生型SHP2基因后大鼠肝组织的SHP2 mRNA及蛋白表达明显升高(均P<0.05),而导入靶向SHP2的shRNA后大鼠肝组织的SHP2 mRNA及蛋白表达明显降低(均P<0.05)。在各造模时间点(第2、4、6、8周),模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组大鼠肝组织ERK1 mRNA及蛋白表达以及p-ERK1蛋白表达高于对照组(均P<0.05),但上述四组大鼠肝组织的ERK1 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05);而在各时间点与模型组及Ad-GFP组大鼠肝组织p-ERK1蛋白表达比较,Ad-SHP2组升高(均P<0.05),Ad-shRNA/SHP2组降低(均P<0.05),模型组与Ad-GFP组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:大鼠纤维化肝组织中SHP2过表达可通过促进ERK1/2磷酸化增强ERK1/2活性,而SHP2低表达则可通过抑制ERK1/2磷酸化降低ERK1/2活性。

RNA干扰下调PTEN表达对体外活化肝星状细胞α-微管蛋白及γ-微管蛋白表达的影响

目的:探讨RNA干扰下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对体外活化肝星状细胞(HSC)α-微管蛋白(α-tubulin)及γ-微管蛋白(γ-tubulin)表达的影响。方法:2017年9月至2018年3月,以腺病毒为载体将靶向PTEN的RNA干扰序列—短发夹RNA(shRNA)转染体外培养的活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,实验分为3组:对照组(Control组,以DMEM代替腺病毒液进行腺病毒转染)、Ad-GFP组(以对照空病毒Ad-GFP转染体外活化HSC)、Ad-shRNA/PTEN组(以携带靶向PTEN的shRNA的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN转染体外活化HSC),每组设6个复孔。采用Western blot及实时荧光定量PCR技术检测各组HSC的PTEN蛋白及mRNA表达;免疫荧光法检测各组HSC的α-tubulin及γ-tubulin表达。结果:与对照组及Ad-GFP组比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的PTEN蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.05)。HSC的α-tubulin主要表达于细胞浆,对照组和Ad-GFP组HSC的α-tubulin呈丝网状、辐射状均匀分布于细胞核周围,而Ad-shRNA/PTEN组HSC的α-tubulin向细胞两端末梢逐渐聚集并在细胞两端稍增多;与对照组HSC的α-tubulin荧光积分光密度值(IOD)(40803.00±2006.59)及Ad-GFP组HSC的α-tubulin荧光IOD(42302.50±2537.93)比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的α-tubulin荧光IOD(101495.17±5005.39)明显升高(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组HSC的α-tubulin荧光IOD比较差异无统计学意义(P>0.05)。HSC的γ-tubulin也主要表达于胞浆,并在胞浆中有散在点状聚集,但Ad-shRNA/PTEN组HSC的γ-tubulin点状聚集更明显;与对照组HSC的γ-tubulin荧光IOD(20410.68±1815.53)及Ad-GFP组HSC的γ-tubulin荧光IOD(20137.50±1469.49)比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的γ-tubulin荧光IOD(41310.83±1544.68)明显升高(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组HSC的γ-tubulin荧光IOD比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:下调体外活化肝星状细胞的PTEN表达可显著增加其α-微管蛋白及γ-微管蛋白表达,并引起上述微管蛋白在胞浆中的分布发生变化。

大鼠纤维化肝组织中SHP1表达与肝星状细胞活化及增殖的关系

目的:探讨大鼠肝纤维化病理过程中肝组织及在体肝星状细胞(HSC)的含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)表达变化与在体HSC活化及增殖的关系。方法:随机将50只健康雄性SD大鼠分为对照组(10只)、模型组(40只),采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纤维化模型,Masson三色染色及HE染色检测大鼠肝脏组织的病理组织学变化,SHP1与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光双标记检测大鼠肝组织中活化HSC的SHP1表达,免疫组织化学染色检测大鼠肝组织的α-SMA及SHP1表达,并分别对大鼠肝组织的SHP1表达及大鼠肝组织中活化HSC的SHP1表达与大鼠肝组织的α-SMA表达进行Pearson’s相关性分析。结果:大鼠肝纤维化模型成功构建,随着造模时间延长,大鼠肝纤维化逐渐加重。与对照组大鼠肝组织的SHP1阳性表达平均光密度值(MOD)(0.08±0.01)比较,造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的SHP1阳性表达MOD(0.11±0.01、0.14±0.01、0.16±0.01、0.19±0.01)显著增加(P<0.05),并逐渐升高(P<0.05)。与对照组大鼠肝组织的α-SMA阳性表达MOD(0.04±0.01)比较,造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的α-SMA阳性表达MOD(0.06±0.01、0.09±0.01、0.12±0.01、0.16±0.02)明显增加(P<0.05),并逐渐升高(P<0.05),即在体HSC的活化及增殖逐渐加快(α-SMA是HSC的活化标志)。SHP1与α-SMA免疫荧光双标记检测显示,造模2周、4周、6周、8周大鼠纤维化肝组织中表达SHP1的活化HSC占总的活化HSC的百分比(26.49%±3.44%、37.14%±4.57%、44.90%±2.94%、58.09%±5.33%)逐渐升高(P<0.05)。上述大鼠纤维化肝组织的SHP1表达及大鼠纤维化肝组织中表达SHP1的活化HSC占总的活化HSC的百分比均与大鼠纤维化肝组织的α-SMA表达呈显著正相关(r值为0.926,0.984,P<0.05)。结论:在大鼠肝纤维病理过程中,肝组织及在体HSC的SHP1表达与在体HSC的活化及增殖呈显著正相关。

腺病毒介导的shRNA下调SHP2表达对人肝星状细胞LX-2凋亡的影响

目的探讨腺病毒介导的短发夹RNA(shRNA)下调含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)对体外培养的人肝星状细胞LX-2凋亡的影响。方法将携带靶向SHP2的shRNA并表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad-shRNA/SHP2及仅表达GFP的对照空病毒Ad-GFP分别转染体外培养的LX-2细胞;实时荧光定量PCR检测LX-2细胞的SHP2 mRNA表达;用Western blot检测LX-2细胞的SHP2、Bax及Bcl-2蛋白表达;TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测LX-2细胞凋亡。实验分组:(1)对照组:以DMEM代替腺病毒转染LX-2细胞;(2)Ad-GFP组:转染空病毒Ad-GFP;(3)Ad-shRNA/SHP2组:转染重组腺病毒Ad-shRNA/SHP2。多组间均数比较用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。结果靶向SHP2的shRNA显著下调LX-2细胞的SHP2蛋白及mRNA表达(P<0.05);TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测结果显示,与对照组LX-2细胞凋亡率(3.077%±0.731%,9.438%±0.804%)及Ad-GFP组(3.250%±0.851%,8.893%±1.982%)比较,Ad-shRNA/SHP2组LX-2细胞凋亡率(12.755%±1.606%,19.340%±2.505%)明显升高(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组之间差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测各组LX-2细胞的Bax及Bcl-2蛋白表达结果显示,与对照组及Ad-GFP组LX-2细胞的Bax蛋白表达(1.989±0.147,1.999±0.162)比较,Ad-shRNA/SHP2组LX-2细胞Bax蛋白表达(2.493±0.203)显著升高(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组之间差异无统计学意义(P>0.05);与对照组及Ad-GFP组LX-2细胞的Bcl-2蛋白表达(1.707±0.146,1.521±0.142)比较,Ad-shRNA/SHP2组LX-2细胞Bcl-2蛋白表达(1.042±0.148)明显降低(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论SHP2表达下调通过降低Bcl-2/Bax诱导体外人肝星状细胞LX-2凋亡。

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织中的动态表达

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在四氯化碳(CCl_(4)诱导的肝纤维化大鼠肝组织中的动态表达。方法采用腹腔注射CCl_(4)的方法建立大鼠肝纤维化模型,用HE和Masson三色染色检测大鼠肝脏组织的病理组织学变化,采用免疫组织化学染色、蛋白质印迹法及实时荧光定量PCR技术检测大鼠肝组织的SHP2蛋白及mRNA表达。多组间均数比较采用单因素方差分析,进一步组间比较采用LSD检验。结果成功构建CCl_(4)诱导的大鼠肝纤维化模型,随着造模时的延长,大鼠肝纤维化程度逐渐加重。免疫组织化学染色结果显示大鼠肝组织的SHP2主要表达于细胞质,随着肝纤维化程度的加重,SHP2阳性表达的细胞逐渐增多(P<0.05)。蛋白质印迹法及实时荧光定量PCR检测结果显示,造模第2、4、6周及第8周不同时间大鼠纤维化肝组织的SHP2蛋白及mRNA表达均高于对照组(P<0.05),并随着肝纤维化的加重逐渐增高(P<0.05)。结论CCl_(4)诱导的肝纤维化大鼠肝组织中SHP2的蛋白及mRNA表达均随着肝纤维化程度的加重逐渐增高,其增高程度与肝纤维化程度一致。

腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对活化肝星状细胞微丝结合蛋白vinculin、filamin A及cortactin的影响

目的探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对活化肝星状细胞(HSC)的纽蛋白(vinculin)、细丝蛋白A(filamin A)及皮层肌动蛋白(cortactin)的影响。方法体外培养活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,将携带靶向PTEN的RNA干扰序列[短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)]的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN及对照空病毒Ad-GFP转染HSC;采用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测各组HSC的PTEN mRNA及蛋白表达;借助激光扫描共聚焦显微镜,采用免疫荧光法检测各组HSC的vinculin、filamin A及cortactin表达变化,并利用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析处理,计算所测蛋白荧光表达的积分光密度值(IOD)。实验分为3组:对照组(在腺病毒转染步骤以DMEM代替腺病毒液)、Ad-GFP组(转染仅表达绿色荧光蛋白的空病毒Ad-GFP)、Ad-shRNA/PTEN组(转染携带靶向PTEN的shRNA并表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN)。3组间均数比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。结果靶向PTEN的shRNA成功转染并显著下调HSC的PTEN mRNA及蛋白表达(P<0.05);HSC的vinculin主要表达于细胞质,Ad-shRNA/PTEN组HSC的vinculin荧光IOD(19758.83±1520.60)较对照组(7737.16±279.93)及Ad-GFP组(7725.50±373.03)显著升高(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组之间HSC的vinculin荧光IOD差异无统计学意义(P>0.05)。3组HSC的filamin A荧光IOD差异无统计学意义(P>0.05),但3组HSC的filamin A亚细胞分布发生了变化,Ad-shRNA/PTEN组HSC的filamin A主要分布于细胞质,而对照组和Ad-GFP组HSC的filamin A主要位于细胞核,Ad-shRNA/PTEN组HSC的filamin A核质比(0.60±0.15)明显低于对照组(1.20±0.15)及Ad-GFP组(1.08±0.23),P<0.05;而对照组与Ad-GFP组之间HSC的filamin A核质比差异无统计学意义(P>0.05)。3组HSC的cortactin主要分布于细胞质,Ad-shRNA/PTEN组HSC的cortactin荧光IOD(54688.50±2095.53)较对照组(22959.94±1710.42)及Ad-GFP组(22547.11±1588.72)显著升高(P<0.05),而对照组与Ad-GFP组之间HSC的cortactin荧光IOD差异无统计学意义(P>0.05)。结论PTEN表达下调使体外活化肝星状细胞的微丝结合蛋白vinculin及cortactin的表达上调,并使另一微丝结合蛋白filamin A的亚细胞分布发生改变即出现胞核向细胞质转位。