牦牛发情周期中卵巢卵泡发育状况的组织学观察

运用组织学技术对36头处于发情周期的健康成年母牦牛卵巢卵泡的结构与发育状况进行了观察。结果表明,牦牛发情周期中卵巢卵泡发育的组织结构与其他牛基本相似。每对卵巢中原始卵泡数和生长卵泡数在发情前期、发情期、发情后期和发情间期之间差异不显著(P>0.05);发情前期的囊状卵泡数与发情期、发情后期和发情间期之间差异不显著(P>0.05),发情期和发情后期均与发情间期差异显著(P<0.05)。闭锁生长卵泡数在4个时期之间差异不显著(P>0.05);发情期的闭锁囊状卵泡数与其他3期之间差异极显著(P<0.01),发情前期和发情间期均与发情后期差异显著(P<0.05)。各级卵泡的闭锁形式各有特点。在生长卵泡、囊状卵泡及相应闭锁卵泡的卵泡膜中均见到了胶原纤维和网状纤维。

猪IFN-γ和IL-4重组质粒对口蹄疫疫苗的免疫佐剂效应研究

为了研究猪IFN-γ和IL-4对疫苗的免疫佐剂效应,用pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4的重组质粒与口蹄疫双价疫苗配伍免疫小鼠,检测小鼠抗口蹄疫抗体水平和CD4+/CD8+T细胞比值的动态变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4重组质粒都能显著提高小鼠抗口蹄疫抗体水平(P<0.01),其中pcDNA3.1/IFN-γ提高亚洲Ⅰ型FMD抗体水平的佐剂效应较pcDNA3.1/IL-4的显著(P<0.01),而pcDNA3.1/IL-4提高O型FMD抗体水平的佐剂效应显著高于pcDNA3.1/IFN-γ(P<0.01),pcDNA3.1也显示出了一定的佐剂效应;免疫后不同时间pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4组CD4+/CD8+T细胞比值显著高于其他组(P<0.01),且第21天与第7、45天的差异极显著(P<0.01)。

小反刍兽疫病毒血凝素蛋白与受体蛋白SLAM的相互作用

旨在利用免疫共沉淀技术验证小反刍兽疫病毒血凝素蛋白和受体蛋白SLAM间的相互作用。鉴于截短的H蛋白仍具有正常的与细胞受体结合的能力,分别构建pcDNA3.1-tH真核表达载体和SLAM及其缺失突变体(m1-胞外区、m2-无信号肽胞外区、m3-胞外区N端29-136位氨基酸和m4-胞外区C端137-240位氨基酸)编码基因的pEGFP-N1系列真核表达载体,将测序正确的重组质粒共转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1细胞株,利用免疫共沉淀技术验证tH蛋白与SLAM蛋白相互作用的关键氨基酸区段。结果表明,成功构建了预期的重组表达载体,转染CHO细胞后目的蛋白正确表达;免疫共沉淀时,tH能与SLAM、m1、m2和m3蛋白发生反应,但没有与m4蛋白发生反应。由此可知,SLAM N端29-136位氨基酸是决定SLAM与PPRV H蛋白结合的关键氨基酸区段,这与麻疹病毒属其他宿主SLAM受体的研究结果一致。

牦牛发情周期黄体组织结构的观察

选用48头成年母牦牛,采用光镜和电镜技术对发情周期中不同时期黄体的组织结构进行了观察。结果表明,牦牛黄体主要由2种细胞组成,即颗粒黄体细胞(granulasa lutein cell,GLC)和膜黄体细胞(theca lutein cell,TLC),其特征性变化主要表现在GLC和纤维的分布。成熟黄体中GLC及其胞核的平均直径分别为36.6μm和15.2μm,而TLC则分别为14.4μm和10.9μm。黄体细胞胞质中线粒体的比例随黄体的成熟而增高;脂滴在期黄体时较多,期时减少,期时显著增多,后又减少;滑面内质网也随黄体的成熟而增加,并随黄体的退化发生膨胀。黄体组织中有同心圆状或同心轮状的粗面内质网膜系统。黄体细胞间主要是缝隙连接,偶见中间连接。黄体组织中存在窗孔型毛细血管。

猪干扰素-γ哺乳动物细胞重组表达质粒作为疫苗佐剂在小鼠体内的组织分布及环境安全性研究

重组表达质粒作为免疫佐剂从实验室走向临床必须解决其对机体和生物环境释放的安全性问题。本研究以pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒作为免疫佐剂进行试验,探讨了其在小鼠体内组织的分布和生物安全性。将pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒经肌肉途径免疫小鼠,免疫后不同时间迫杀,并取各种组织抽提基因组DNA:一是利用PCR技术检测其在组织内的分布及与细胞基因组发生整合的可能性;二是以PCR技术检测免疫动物现场环境样品,监测pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒中的猪IFN-γ基因、CMV启动子基因和抗性基因是否转移和扩散到环境细菌中。结果表明,免疫24h后在小鼠的各组织中仅注射部位肌肉存在重组表达质粒,免疫5d后仅有1只小鼠注射部位肌肉和血液中存在重组表达质粒,免疫15d后所有动物的各组织中无重组表达质粒存在;同时未发现pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒整合到宿主细胞基因组和转化到环境其他细菌中。因此,认为pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒对动物和环境是安全的。

哺乳动物发情周期黄体的组织学研究进展

黄体是排卵后形成的暂时性的内分泌组织 ,在一个较短的存在期限中经历了一系列的结构变化和分泌阶段 ,对于哺乳动物维持正常的生殖功能具有重要作用。人们对黄体细胞的来源、组成、形态及大小持有不同的观点。近年来 ,人们就黄体细胞的功能和退化、溶解进行了较为深入的研究 ,发现不同动物黄体细胞的功能各有不同 ,黄体退化、溶解与细胞凋亡有密切关系。了解哺乳动物发情周期黄体的组织结构对于控制动物的繁殖具有重要意义。文章对哺乳动物发情周期黄体中不同类型黄体细胞的来源、组成、形态、功能及退化、溶解 。

小反刍兽疫病毒细胞膜受体的鉴定

【目的】对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白胞外区(tH)细胞膜受体进行鉴定,为PPRV致病机制的研究奠定基础。【方法】克隆PPRV H基因胞外区(tH),在毕赤酵母(Pichia pasto-ris)中进行真核表达,纯化后免疫家兔,获得兔抗PPRV-tH蛋白特异性抗体;提取山羊外周血淋巴细胞膜蛋白,经SDS-PAGE检测后,湿转印法转印至NC膜,分别利用纯化的重组tH蛋白和PPRV进行病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA),对受体进行鉴定。【结果】成功克隆了1 653bp的PPRVtH基因,构建其重组酵母表达质粒pPIC9K-tH,诱导表达后获得了60ku目的蛋白。重组tH蛋白免疫家兔后获得了效价为1∶200的抗血清。Western-blotting分析发现,该重组蛋白可与PPRV多克隆抗体发生特异性反应,山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上有2个与PPRV和重组tH蛋白结合的蛋白带,分子质量约为38和100ku。【结论】从山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上鉴定到了2种与PPRV结合的蛋白组分,其特性有待于进一步研究。

双峰驼精蛋白的提取及其抑菌特性的初探

本研究采用超声波、凝胶层析等方法，提取、纯化了双峰驼睾丸组织中的精蛋白；以主要的食品污染菌为对象，对双峰驼精蛋白的抗菌特性进行了初步研究。实验结果表明：利用超声波技术提取精蛋白时，硫酸用量少，提取时间短，并且多提取的双峰驼精蛋白活性高，其大小在15～18ku，对金色葡萄球菌有明显的抑菌效果。

猪白介素-4重组表达质粒在小鼠体内的组织分布及环境释放安全性

为了探讨pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒作为疫苗佐剂进入临床应用的生物安全性,本试验就pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒在小鼠体内的组织分布和环境释放安全性进行了研究。将pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒经肌肉途径免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间剖杀动物并摘取各种组织,抽提基因组DNA。利用PCR技术分析其在组织内的分布及与细胞基因组发生整合的可能性,同时检测了免疫动物现场环境,以监测pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒上的猪IL-4基因、CMV启动子基因和抗性基因是否在环境细菌中发生转移和扩散。结果表明,免疫后1d在3/3小鼠各组织中仅注射部位肌肉存在重组表达质粒,免疫后5d仅有1/3小鼠于注射部位肌肉中存在重组表达质粒,免疫后15d所有小鼠的各组织中无重组表达质粒存在;未发现pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒整合到宿主细胞基因组和转化到环境其他细菌中。因此,认为pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒对动物和环境是安全的。

羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-P32、pcDNA3·1-CpG-P32和pcDNA3·1-CpG-MP32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞亚群。结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达P32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4+T细胞数目和CD4+/CD8+T细胞比值明显高于对照组。结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答。

猪白介素-18基因的克隆及其序列分析

通过对猪PBMC刺激诱导 ,提取总RNA ,然后采用RT PCR技术克隆了猪白介素 18(pIL 18)基因。序列分析结果表明 ,克隆的 pIL 18基因序列与GenBank上登录的 pIL 18基因序列完全一致 ,与其他各物种的IL 18基因间具有较大的种属差异性。该基因在国内的成功克隆为IL

小反刍兽疫病毒P基因的克隆及其结构与功能分析

【目的】对小反刍兽疫病毒P基因进行克隆,并对其结构和功能的关系进行分析,为研究小反刍兽疫病毒P蛋白的功能及其在病毒增殖过程中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR的方法对小反刍兽疫P基因全长进行克隆,通过生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对,利用I-TASSER进行三级结构预测,然后分析其结构和功能之间的关系。【结果】P基因和MV、CDV、RPV、DMV和PDV的P基因的相似性分别为62.9%、63.3%、64.4%、65.1%和60.4%,氨基酸的相似性分别为45.9%、46.2%、50.6%、50.3%和47.0%。三级结构表明该蛋白由3个结构域构成,中间是由多个α-螺旋构成的结构域,主要行使与L大蛋白和RNA结合的功能,两边分别是N-端和C-端结构域,C-端结构域含有3个α-螺旋,分别位于458—468aa、492—499aa和503—505aa位,主要作为N蛋白α-螺旋的结合位点。【结论】本研究成功地克隆小反刍兽疫病毒P基因,分析和预测了p蛋白的结构和功能的关系,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。

CpG DNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应

作者应用含CpG基序序列的重组质粒（即CpG DNA）作为免疫佐剂,评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗的免疫增强效果。结果表明：CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠,CpG DNA重组质粒对小鼠具有较强的免疫佐剂效应,能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体,其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍。CpG DNA重组质粒与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪,其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上,也显著高于空载体疫苗对照 与病毒纯化抗原配伍免疫动物,攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00,远高于标准疫苗对照（PD504.69）。在CpG DNA重组质粒剂量选择试验中,含低剂量的CpG DNA疫苗（50、200μg.头份-1）都比高剂量组（500μg.头份-1）诱导的抗体滴度高,其中50和200μg.头份-1的CpG DNA剂量,在接种后14~32 d诱导的抗体滴度高达1∶1500,是标准疫苗的4~5倍,而500μg.头份-1剂量诱导的抗体仅是标准疫苗的2倍,说明CpG DNA重组质粒在低剂量时即可发挥强烈的佐剂效应。研究表明CpG DNA对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗有较强的免疫佐剂效应,且使用剂量低,应用前景广阔。

猪白介素家族重要基因的克隆、表达及其结构与功能预测分析

【目的】克隆、表达和预测分析猪白介素家族重要成员的结构与功能。【方法】以猪白介素基因家族为对象,通过对猪PBMC刺激诱导,提取RNA,采用RT-PCR技术克隆IL-4、IL-6、IL-18等重要功能基因,并进行原核表达和结构与功能分析。【结果】成功地克隆和表达了IL-4、IL-6和IL-18基因,序列分析发现,克隆的基因与NCBI/GenBank上登载的参考序列的同源性分别为99.25%、99.21%和100%,与其它各物种的基因及其编码蛋白间具有较大的种属差异性;在大肠杆菌中表达的IL-4和IL-6重组蛋白具有较高的生物活性;结构预测表明,这些蛋白分子均含有较多的磷酸化修饰、糖基化修饰(除IL-6)、蛋白激酶以及信号传导结合位点,其中IL-4、IL-6蛋白分子的螺旋化程度较高,均在60%左右,水溶性较低,但这3种蛋白的立体空间结构均为致密的球状,说明该结构特征是其多种生物学功能发挥的基础。【结论】本研究成功地克隆、表达和分析了猪白介素家族的IL-4、IL-6和IL-18等重要分子的结构与功能,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。

猪IFN-α_1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因。序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%。用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1。探讨了猪IFN-α1基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达。结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%。SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在。经预测,猪IFN-α蛋白为一结构松散的球状蛋白。

慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID_(50)·0.1mL^(-1)由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。

猪白细胞介素-4基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与Gen-Bank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%。然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础。

CpG ODN增强猪囊尾蚴病疫苗免疫反应的试验研究

依据CpG基序的生物学和免疫学特性 ,人工设计合成了硫代修饰的多种CpGODN序列 ,通过兔、小鼠和猪体进行了与铝胶、2 0 6佐剂和蜂胶佐剂的配伍和比较试验 ,用ELISA法测定加单一佐剂或联合佐剂组疫苗诱导的抗猪囊尾蚴病的抗体含量 (IgG或IgG2a)和效价 ,用MTT淋巴细胞转化试验法测定刺激指数 ,进一步证实了CpG基序的种类、数量和空间结构以及与其他佐剂联合对疫苗免疫反应的影响 ,CpG基序以 1个TpC的 5′端开始 ,紧接着 3个GTCGTT基序 ,基序与基序之间由TpT或T分隔 ,在兔、小鼠和猪都能诱导机体产生强烈的免疫反应特别是细胞免疫反应。

猪白细胞介素-4重组蛋白的纯化及其生物学特性分析

用已构建好的重组表达载体pGEX-4T-IL-4转染E.coli,在最适条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表达出38 ku的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的25%,表达产物主要以包涵体的形式存在;对表达产物经变性、复性及初步纯化后再结合饱和硫酸铵沉淀和Sephadex-G100凝胶层析柱进一步纯化,所得蛋白的纯度约在90%以上。在体外利用MTT法检测其生物学特性,结果表明其具有较好的生物学活性,本试验为获得猪IL-4重组蛋白奠定了基础。

猪Toll样受体2基因的克隆和序列分析

本研究从猪肠系膜淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体2基因(pTLR2)。基因序列分析表明,克隆的pTLR2基因ORF为2358bp,编码785个氨基酸,含15.01%的亮氨酸,含有一段21个氨基酸的信号肽序列;与GenBank中登录的pTLR2序列(NM_213761)的同源性为99.2%;与牛、马、绵羊和人的同源性较高,与家鼠、中国仓鼠相比次之,而与鱼类的最低。蛋白分子结构预测表明,该分子由胞外区(588个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(174个氨基酸)组成,其胞外结构域由多个串联重复的LRR基序(XLXXLXLXX)组成,而胞内区含有与人白细胞介素1受体(IL-1R)高度同源的区域即TOLL/IL-1受体同源区(TIR),说明pTLR2分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用,这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。