大鼠死后心肌和肺脏微管蛋白降解规律的初探研究

目的探讨大鼠死后心肌和肺脏微管蛋白(tubulin)的降解规律与死亡时间(PMI)的关系。方法大鼠经切断股动脉致失血性休克处死后,置于RXZ智能型人工气候箱内,实验条件设定为:20℃恒温,湿度50%。分别于大鼠死后0、1、2、3、5和7d时剖取心肌和肺脏组织,应用Western-Blot法检测心肌和肺脏tubulin的含量,并对所得数据进行统计学分析。结果Tubulin在正常大鼠心肌和肺内高表达,死后1d时其含量已开始下降,至死后7d时仍可检测到微管蛋白的存在,但tubulin在肺脏内的降解速度快于心肌。两种组织内tubulin含量随PMI变化的回归方程及相关系数分别为:心肌y=-1726.1x+14083,r=0.9684;肺脏y=-1439.89x+12041,r=0.9808。结论大鼠死后心肌和肺脏tubulin的含量逐渐减少,与PMI具有相关性。

大鼠死后肌动蛋白降解与死亡时间的相关性

目的观察大鼠死后不同时间心肌、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌肌动蛋白(actin)的降解规律,为晚期死亡时间(postmorteminterval,PMI)的推断寻找客观指标。方法28只SD大鼠随机分为7组,经机械性窒息致死后,分别置于20℃恒温箱内,于0、24、48、72、96、120和168h后剖取以上器官,应用免疫印迹技术检测各组织内actin的含量,SPSS11.5软件对所得数据进行方差分析。结果大鼠死后上述各器官actin含量均随PMI的延长而逐渐下降,与PMI相关,决定系数(R2)均在0.75以上。但actin在上述各器官内的降解速度有显著差异(P<0.05),在脑组织中降解速度最快,其余依次为肺、脾、肝、肾、心肌和骨骼肌。结论尽管大鼠死后心肌、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌actin的降解规律具有组织差异性,但是actin在上述组织中的含量变化与PMI相关,有助于较晚期PMI的推断。

大鼠骨骼肌肌钙蛋白I与死亡及离体时间的相关性探讨

目的研究大鼠骨骼肌肌钙蛋白I(sTnI)在体和离体两种情况下的降解规律及其相互间的异同,探讨较晚期死后经过时间的推断方法。方法以大鼠骨骼肌组织为研究对象,利用免疫印迹(Westernblot)结合图像分析技术半定量检测不同死亡(离体)时间内大鼠sTnI的含量,观察其与死亡(离体)时间的关系及相互间的异同。结果大鼠sTnI的含量随死亡(离体)时间延长而逐渐下降,且与死亡(离体)时间的对数值均呈近似的线性关系,但在体情况下要比离体情况下降解慢。结论sTnI有望用于推断较晚期死后经过时间;sTnI在体与离体条件下的降解情况并不完全一致。

大鼠心肌肌钙蛋白I与在体及离体降解时间的相关性

目的研究大鼠心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)在体和离体两种情况下的降解规律及其相互间的异同,探讨死后经过时间的推断方法。方法以大鼠心肌组织为研究对象,利用免疫印迹(Western blot)结合图像分析技术半定量检测不同死亡(离体)时间内大鼠cTnI的含量,观察其与死亡(离体)时间的关系并比较这两种关系间的异同。结果大鼠cTnI的含量随死亡(离体)时间延长而逐渐下降,且与死亡(离体)时间的对数值均呈近似的线性关系,但在体情况下要比离体情况下降解慢。结论cTnI有望用于推断死后经过时间。cTnI在体与离体条件下的降解规律并不完全一致。

失血性休克大鼠肝肾脾细胞微管蛋白死后降解的检测

目的探讨失血性休克大鼠肝肾脾细胞微管蛋白含量变化与死亡时间(PMI)的关系。方法大鼠经切断股动脉致失血性休克死亡后,分别于死亡即刻和死后1、2、3、5和7d剖取脾脏、肝脏及肾脏组织,应用western-blot技术检测微管蛋白含量,SPSS 11.5软件对结果进行统计学分析。结果大鼠肝肾脾细胞内微管蛋白含量随PMI的延长而逐渐降低,至死后7d仅可见很淡的微管蛋白印记谱带,其中微管蛋白在肝脏内降解速率最快。3种组织内微管蛋白含量变化的回归方程及相关系数(r)分别为:肝脏Y=-2221.1X+14844,r=0.9823;脾脏Y=-1871.1 X+11344,r=0.9749;肾脏Y=-1878.1 X+13715,r=0.9629。结论大鼠死后肝肾脾细胞内微管蛋白降解规律与PMI之间具有相关性,并存在组织差异性。

K252a对局灶性脑缺血大鼠神经保护作用的在体研究

目的研究K252a对大脑中动脉栓塞导致的大鼠局灶性脑缺血模型的作用。方法成年雄性SD大鼠，随机分为K252a组、溶剂对照组、手术组和假手术组，采用大脑中动脉栓塞法建立局灶性脑缺血模型，于造模前30min分别侧脑室注射K252a、溶剂或不予处理，造模前和复灌后24h分别进行行为学评分，动物处死后进行TTC染色，计算梗死体积百分比。结果K252a能够改善大鼠的行为，减少梗死体积。结论K252a对局灶性脑缺血导致的损伤具有保护作用。

Apelin-13对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究

目的:研究Apelin-13对缺血/再灌注小鼠脑损伤的作用,并初步探讨其对自噬性细胞死亡的影响。方法:取健康雄性CD-1小鼠,随机分为假手术(sham)组、生理盐水(Saline)组、Apelin组;Apelin组和Saline组首先建立脑缺血再灌注(MCAO/R)模型,再灌注即刻给予同侧侧脑室注射Apelin-13或等量生理盐水,然后在再灌注48 h后,进行神经功能方面检测,同时利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评估脑梗死体积;缺血再灌注24 h和48 h后,采用West-blot法检测各组自噬相关蛋白LC3的表达情况。结果:Apelin-13可显著降低小鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损症状,减少脑梗死体积,减低自噬相关蛋白LC3的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。结论:Apelin-13对小鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用,抑制神经细胞的自噬性死亡可能是其作用机制之一。

非法医专业留学生CBL教学的应用与思考

为了推进医学院校教学改革,适应培养高素质医学人才的需要,同时提高非法医专业留学生对法医课程的学习积极性与主动性,我们结合本校非法医专业留学生学习法医学课程的实际情况,探索CBL教学方法在法医课教学中的合理应用。通过学生的反馈与任课老师的评价相结合,分析总结CBL的运用体会。

颗粒蛋白前体小干扰RNA提高小鼠皮肤创面修复的质量

为探讨颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)小干扰RNA对提高小鼠切创损伤创面愈合质量的作用,通过选取33只健康雄性BALB/c小鼠,制作小鼠背部皮肤孔状切除模型,按照处理因素不同随机分为3组:健康小鼠对照组(Control组)、溶剂+皮肤孔状切除组(Vehicle组)和Si-m-PGRN+皮肤孔状切除组(Si-m-PGRN组)。分别于造模后0、4、8、12、16 d背部皮下注射30μL的生理盐水或Si-m-PGRN。各组小鼠分别于4、8、12、16、20 d麻醉处死取材,采用大体观察、常规组织学检查和免疫组织化学染色等方法研究了创面愈合情况。结果表明:注射Si-m-PGRN后,PGRN在伤口处表皮和真皮中表达较低。Si-mPGRN 组与 Vehicle 组在伤后4、8、12、16 d相比,创面面积缩小明显,愈合率较快,新生表皮的细胞层数较多,表皮较厚,分层明显,伤口的再上皮化加速,上皮层次明显;伤后20 d,Vehicle 组和Si-m-PGRN组的上皮厚度与Control组相比显著较厚,而两组之间创面面积、愈合率,新生表皮的厚度均无差异。可见PGRN小干扰RNA分子在皮肤损伤愈合前期能提高小鼠皮肤伤口愈合率、增加新生表皮厚度,加快伤口的再上皮化速度,而在皮肤损伤愈合后期无明显作用,表明PGRN小干扰RNA在一定程度上可以显著提高创面愈合的质量。

兔后肢失用后兰诺定受体与受磷蛋白mRNA转录水平的变化

探讨参与肌浆网中钙离子释放的兰诺定受体(ryanodine receptor,RyR)、受磷蛋白(phospholamban,PLN)的mRNA转录水平与失用性肌萎缩的关系。将依次编号的30只新西兰大白兔按随机数字法分为6组。分别设置为对照组和实验组5组。实验组采用长腿石膏固定法建立兔失用性肌肉萎缩模型,于2周、4周、6周、8周、10周分别处死兔子5只。对照组于第10周处死兔子5只。取固定侧肌肉组织,用定时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定兔固定侧肌肉的RyR与PLN的基因转录水平。RyR的mRNA转录水平在第2周升高,自第2周开始转录水平逐渐下降。PLN的mRNA转录水平表现为逐渐下降的趋势。在失用性萎缩发展过程中,PLN和RyR mRNA随着肌肉萎缩程度的不断加深呈现趋势性变化,可望用于失用性肌萎缩程度的推断。

利用圆二色谱法研究突变体BFR分子稳定性

通过引入人为突变,研究BFR纳米蛋白分子的稳定性与其一级结构的关系,探索蛋白质序列与结构的关系。选择可能与BFR构象密切相关的氨基酸残基引入突变,经表达、纯化后,利用圆二色谱仪检测突变体蛋白分子的结构变化。结果关键部位氨基酸的突变可以引起BFR分子中α螺旋含量及熔链温度发生了显著的变化。说明某些氨基酸的改变会引起BFR分子整体结构与稳定性的变化,有可能影响甚至改变蛋白质分子的功能。

圆二色谱法测定饥饿细胞DNA结合蛋白的突变热点

目的通过引入人为突变,研究DPS分子的稳定性与其一级结构的关系,寻找新型DPS分子。方法选择可能与DPS构象密切相关的氨基酸残基引入突变,经表达、纯化后,利用圆二色谱仪检测突变体蛋白分子的结构变化。结果关键部位氨基酸的突变可以引起DPS分子中α螺旋含量发生了显著的变化。结论某些氨基酸的改变会引起DPS分子整体结构与稳定性的变化,有可能影响、甚至改变蛋白质分子的功能。

创伤后应激障碍小鼠海马神经细胞内FoxO3a和LC3蛋白的表达变化

目的研究创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder,PTSD)小鼠海马神经细胞内FoxO3a和LC3蛋白表达的变化。方法采用单一连续刺激(single prolonged stress,SPS)方法建立PTSD小鼠模型,应用旷场实验、高架十字迷宫、Morris水迷宫3种行为学检测方法测试SPS刺激后小鼠的空间记忆能力和焦虑水平,通过Western blot法检测海马神经细胞自噬相关蛋白LC3、p62以及信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a的表达,并利用免疫荧光染色方法观察FoxO3a、LC3的表达水平。结果行为学实验检测结果显示,与Control组比较,PTSD组小鼠焦虑水平升高及空间记忆受损(P<0.01);Western blot法和免疫荧光染色结果显示,PTSD组小鼠海马神经细胞p-Akt蛋白水平增加,FoxO3a蛋白表达增加,p-FoxO3a蛋白表达减少,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加,p62蛋白水平降低(P<0.05);海马神经细胞内FoxO3a和LC3荧光表达强度增加。结论SPS刺激后PTSD小鼠海马神经细胞自噬增多,FoxO3a表达增加。

Apelin-13对创伤后应激障碍模型小鼠行为学和海马自噬通路的影响

目的研究Apelin-13对创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder,PTSD)模型小鼠行为学的影响及其神经机制。方法32只SPF级雄性C57BL/6J小鼠,6周龄,采用随机数字表法分为4组(每组n=8):对照组、模型组、生理盐水组、Apelin-13组。采用单一连续刺激(single-prolonged stress,SPS)法制备PTSD模型,生理盐水组和Apelin-13组小鼠在PTSD造模后分别给予侧脑室微量注射0.9%氯化钠溶液(2μL)和Apelin-13(1.5μg/μL,2μL)。采用旷场实验、高架十字迷宫实验、Morris水迷宫实验评估小鼠的行为学改变,采用苏木素-伊红染色观察海马的形态结构,采用Western blot检测海马磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated-PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated-Akt,p-Akt)、叉头框蛋白O3a(forkhead box O3a,FoxO3a)及磷酸化FoxO3a(phosphorylated-FoxO3a,p-FoxO3a)、自噬相关蛋白包括微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和SQSTM1蛋白(sequestosome 1,p62)的表达。采用SPSS 26.0进行数据分析,水迷宫4 d重复学习训练的逃避潜伏期数据采用重复测量方差分析,其他数据多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验和Tamhane检验。结果(1)旷场实验结果显示,4组小鼠在中央区活动路程和停留时间均差异有统计学意义(F=15.37,9.63,均P<0.05)。模型组小鼠中央区活动路程[(0.06±0.03)m]和停留时间[(2.48±1.02)s]均少于对照组[(0.19±0.05)m,(15.00±8.91)s](均P<0.05)。Apelin-13组小鼠的中央区活动路程[(0.12±0.04)m]和停留时间[(13.56±7.64)s]均高于模型组[(0.06±0.03)m,(2.48±1.02)s]和生理盐水组[(0.06±0.02)m,(2.82±1.52)s](均P<0.05)。高架十字迷宫结果显示,4组小鼠进入开放臂的次数和停留时间均差异有统计学意义(F=10.74,19.12,均P<0.05)。模型组小鼠进入开放臂的次数[(4.50±2.51)次]和停留时间[(26.95±17.48)s]均少于对照组[(13.75±4.71)次,(103.75±42.43)s]和Apelin-13组[(10.00±5.18)次,(55.98±19.49)s](均P<0.05)。Morris水迷宫结果显示,在4 d的学习训练中,4组小鼠逃避潜伏期的时间和组别交互作用不显著(F=1.15,P=0.34),但时间主效应和组别主效应显著(F=131.65,16.98,均P<0.05)。第2~4天,模型组小鼠的逃避潜伏期长于对照组和Apelin-13组(均P<0.05);Apelin-13组小鼠穿越原平台次数和靶象限停留时间均多于模型组和生理盐水组(均P<0.05)。(2)HE染色结果显示,模型组和生理盐水组小鼠海马CA1区及CA3区神经元排列疏松紊乱,神经元肿胀呈透明空泡化;对照组和Apelin-13组小鼠神经元排列较为致密整齐。(3)Western blot结果显示,4组间的p-PI3K、p-Akt、p-FoxO3a、p62蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率均差异有统计学意义(F=21.37,37.35,20.71,13.26,37.65,均P<0.05)。Apelin-13组小鼠p-PI3K、p-Akt、p-FoxO3a和p62蛋白水平[(0.92±0.07),(0.90±0.09),(0.89±0.13),(1.03±0.08)]均高于模型组[(0.59±0.04),(0.50±0.07),(0.49±0.11),(0.68±0.04)]和生理盐水组[(0.61±0.06),(0.50±0.08),(0.53±0.11),(0.70±0.05)](均P<0.05),Apelin-13组小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率(0.60±0.06)低于模型组(0.92±0.10)和生理盐水组(0.99±0.05)(均P<0.05)。结论Apelin-13可以改善PTSD小鼠焦虑样行为,提高空间学习记忆能力,其机制可能与上调PI3K/Akt/FoxO3a自噬通路有关。

小鼠脑外伤后Apelin-13对自噬相关蛋白表达的影响

目的观察Apelin-13对小鼠脑外伤(Traumatic brain injury,TBI)自噬相关蛋白的影响,并初步探讨其对小鼠脑外伤后自噬相关蛋白调节的作用机制。方法取健康雄性CD-1小鼠,随机分为假手术(sham)组、生理盐水(saline)组、Apelin-13组。Apelin-13组和saline组在建立脑外伤模型前10min,分别注射Apelin-13(0.3μg/g)或等量生理盐水于侧脑室,然后利用Western-Blot检测脑外伤后24h、48h组大脑皮质自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin-1和Bcl-2等的表达情况。结果与sham组相比,在脑外伤后24h、48h,saline组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,Beclin-1的蛋白表达均被显著上调(P<0.01);同时Bcl-2、P62的蛋白表达水平被显著下调。然而,与saline组相比,Apelin-13组可显著下调自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1的蛋白表达水平(P<0.01);同时显著上调Bcl-2和P62的表达水平;亦明显降低Beclin-1/Bcl-2的比值。结论 Apelin-13可以明显抑制脑外伤后小鼠大脑皮质细胞的自噬活性,这一作用可能是通过调节Beclin-1、Bcl-2蛋白表达水平来实现的。