雄黄对人乳腺癌细胞MCF-7增殖及凋亡的影响

目的:研究雄黄对人乳腺癌细胞MCF-7增殖及凋亡的影响。方法:采用MTT法检测不同质量浓度的雄黄对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响;Hoechst 33258染色法观察药物作用MCF-7细胞后细胞形态的变化;流式细胞术检测药物对MCF-7细胞周期和凋亡率的影响。结果:与空白对照组相比,雄黄可显著抑制MCF-7细胞增殖(P<0.01),且呈现浓度和时间依赖性;Hoechst 33258染色和Annexin V-FITC/PI双染法结果显示,80和160μg·ml^-1雄黄处理MCF-7细胞24 h后能有效诱导其凋亡(P<0.05),且随药物浓度的增加,凋亡细胞明显增多;PI单染法检测周期结果显示,不同质量浓度雄黄处理MCF-7细胞24 h,与空白对照组比较,给药组表现为G0/G1期细胞减少,G2/M期细胞则显著增加,其中各药物组G0/G1期、G2/M期与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:雄黄可显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖,同时可诱导其凋亡和G2/M期阻滞。

霍山石斛两个碳糖基转移酶基因的克隆及序列分析

本研究以霍山石斛(Dendrobium houshanense)叶片为研究材料,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)获得两个UDP-葡萄糖:2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶(2-hydroxyflavanone C-glucosyltransferase, UFCGT)全长基因,并对这两个基因编码的蛋白质进行分析和功能预测。结果表明,UFCGT1和UFCGT2基因序列长度分别为1 022和1 187 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF)长度分别为966和933 bp,编码蛋白均为酸性、疏水性、非跨膜蛋白,与兰科(Orchidaceae)植物铁皮石斛(Dendrobium catenatum)、桃红蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris)聚为一支,均无信号肽和跨膜域的存在。UFCGT1有27个潜在磷酸化位点和1个N-糖基化位点,定位于线粒体。UFCGT2有15个潜在的磷酸化位点而无糖基化位点,定位于细胞膜外。本研究为阐明黄酮碳苷类化合物生物合成途径提供一定的参考。

霍山石斛不同部位总黄酮的含量比较及黄酮类成分分析

目的比较霍山石斛不同部位的总黄酮含量,并对其叶中黄酮类成分进行定性鉴别,明确霍山石斛黄酮积累部位及黄酮化合物组成。方法采用AlCl3比色法测定霍山石斛不同部位的总黄酮含量;应用超高效液相色谱-四级杆/飞行时间串联质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)技术鉴定其不同部位的黄酮类化合物,使用Altima UHPLC C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以0.4%甲酸(A)-甲醇(B)为流动相进行梯度洗脱,流速0.9 mL·min^(-1),柱温35℃。采用加热电喷雾离子化源(H-ESI),负离子模式下采集数据,使用MassLynx V4.1软件处理数据。结果霍山石斛不同部位中总黄酮含量比较:叶>茎>根,分别为2.06、0.630、0.477 mg·g^(-1),三者存在显著性差异;在霍山石斛根、茎、叶中分别鉴定出53、61、68种黄酮类化合物。其化合物的类型主要以双碳糖苷为主,苷元主要是芹菜素。结论霍山石斛中黄酮类化合物主要在叶中积累,其化学组成类型丰富,该研究结果可为霍山石斛的进一步开发利用提供依据。

大叶蛇葡萄类纤维素合成酶基因的克隆及其序列分析

目的:从药用植物大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla中克隆得到类纤维素合酶(Cellulose synthase-like,Csl)基因(Am Csl)全长,并对序列进行生物信息学分析。方法:根据大叶蛇葡萄A. megalophylla转录组测序数据得到的Am Csl基因序列设计特异引物,以嫩叶总RNA逆转录的c DNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增Am Csl基因全长,并进行TA克隆测序,利用多种软件对该序列进行生物信息学分析。结果:Am Csl全长c DNA为1 438 bp,包含1个561 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码186个氨基酸,蛋白质分子式为C1011H1547N233O257S10,理论相对分子质量为22. 40 k Da,理论等电点(PI)为7. 59,脂肪族指数(AI)为116. 88,存在跨膜区,无信号肽,可能定位于内质网膜,平均疏水系数为0. 670,不稳定指数为42. 56,属于疏水性不稳定蛋白,保守结构域包含了1个纤维素合成酶超家族结构域,二级结构以α-螺旋为主。氨基酸多序列比对和系统进化树分析发现,Am Csl与同科植物葡萄有较高的同源性。结论:获得了大叶蛇葡萄Am Csl基因的全长,对其进行了初步的生物信息学分析,为进一步研究大叶蛇葡萄多糖的积累和生物合成的调控奠定了必要基础。

霍山石斛β-1,4-木糖基转移酶(IRX9)基因克隆及生物信息学分析

目的克隆霍山石斛β-1,4-木糖基转移酶(IRX9)基因,并进行生物信息学、密码子偏性分析。方法根据霍山石斛转录组数据获得的IRX9基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术得到IRX9基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析。结果霍山石斛IRX9基因全长1 553 bp,包含一个长度为1 047 bp的开放阅读框,编码348个氨基酸,理论相对分子质量为39 350,等电点为7.26,为不含信号肽的亲水性稳定蛋白,定位于质膜,具有多个磷酸化位点和糖基化位点。系统进化树表明,该序列与同科植物铁皮石斛的同源性最高,且具有GT-A超家族的保守区域"DXD"。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有27个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论成功克隆IRX9基因,为从分子水平调控霍山石斛的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础。

大叶蛇葡萄类黄酮-3'-羟化酶基因(F3'H)的克隆及生物信息学分析

类黄酮-3’-羟化酶(F3’H)是黄酮化合物生物合成过程中的关键酶之一,本研究从大叶蛇葡萄转录组数据库中筛选出类黄酮-3’-羟化酶基因(F3’H),利用RT-PCR等技术克隆了其全长序列,并分析F3’H基因编码蛋白的理化性质和结构特征。结果表明,该序列全长为1718 bp,开放阅读框(ORF)长度为1530 bp,相对分子质量为55.89 kD,编码509个氨基酸,等电点为7.3,分子式为C2(513)H3974N696O705S21,不稳定指数为38.26,为稳定蛋白;脂肪族指数为96.42,总平均疏水性为-0.004,为亲水性蛋白;具有多个磷酸化位点,有信号肽,存在一个跨膜区,亚细胞定位于内质网膜,二级结构以α-螺旋为主。系统进化分析和多重序列比对表明该序列与藤茶的亲缘关系最近。密码子偏性分析表明该基因以G/C结尾的密码子使用频率较高,最适合该基因的异源表达宿主是大肠杆菌。本研究结果为进一步研究大叶蛇葡萄F3’H蛋白功能,以及揭示该植物中具生物活性的黄酮类成分的生物合成机制提供了一定的基础。