内质网蛋白TMEM166对MPP^(+)诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激的影响及其机制

目的借助1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP^(+))诱导的SH-SY5Y帕金森病(Parkinson’s disease,PD)细胞模型,研究内质网跨膜蛋白166(TMEM166)对PD细胞模型氧化应激的影响及其机制。方法将SH-SY5Y细胞分为A、B、C、D、E、F组,A~C组分别用0、1.0和1.5 mmol/L的MPP^(+)各处理24、48、72 h;D、E组分别转染Myc-TMEM166质粒和Myc空质粒,再用1.0 mmol/L MPP^(+)处理24 h;F组转染Myc-TMEM166质粒后,再用1.0 mmol/L MPP^(+)和1.0 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)共处理24 h。采用CCK-8法检测细胞相对活力,采用活性氧(ROS)检测试剂盒检测ROS生成情况,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测细胞TMEM 166 mRNA的表达水平,采用蛋白质印迹(Western blot)实验检测细胞中TMEM166蛋白及自噬相关蛋白p62和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平。结果B、C组SH-SY5Y细胞在不同时间的相对细胞活力比较具有显著差异(F=58.56、35.81,P<0.05);在同一时间点,各组细胞的细胞相对活力比较也有显著差异(F=21.56~45.16,P<0.05)。MPP^(+)处理24 h后,A、B组SH-SY5Y细胞ROS生成水平比较有显著差异(t=25.94,P<0.05)。随着MPP^(+)处理浓度增高,A~C组细胞中TMEM166蛋白表达水平逐渐下降(F=290.80,P<0.05),而TMEM 166的mRNA水平逐渐升高(F=315.20,P<0.05)。D组和E组相比,MPP^(+)处理导致的SH-SY5Y细胞ROS生成水平、细胞相对活力、p62蛋白水平和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平有显著差异(t=2.91~6.69,P<0.05)。与D组相比,F组SH-SY5Y细胞中ROS生成明显减少(t=3.91,P<0.05)。结论TMEM166可能通过增强自噬加重MPP^(+)诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激。

miR-1250-3p对肝细胞癌细胞侵袭迁移能力的影响及其作用机制

目的探究miR-1250-3p对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞侵袭和迁移能力的影响及其作用机制。方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-1250-3p在正常肝细胞L02和HCC细胞系QGY-7703、PLC/PRF/5、HccL-M3中的表达情况;将QGY-7703细胞分为A、B、C、D、E、F 6组,各组分别转染mimics NC、mimics miR-1250-3p、inhibitor NC、inhibitor miR-1250-3p、Myc-EVA1A+mimics miR-1250-3p、Myc-EVA1A,采用Western blot方法检测自噬相关蛋白EVA1A的表达,采用细胞划痕法检测miR-1250-3p表达对QGY-7703细胞迁移能力的影响,采用Transwell实验检测miR-1250-3p对QGY-7703细胞侵袭能力的影响。将293T细胞按实验需求分为G、H、I、J组,各组分别转染EVA1A-3′UTR-wt+mimics NC、EVA1A-3′UTR-wt+miR-1250-3p mimics、EVA1A-3′UTR-mu+mimics NC、EVA1A-3′UTR-mu+miR-1250-3p mimics,检测每组荧光素酶的活性以分析miR-1250-3p对EVA1A的靶向调控作用。结果RT-qPCR结果显示,HCC各细胞系中miR-1250-3p的表达均高于正常肝细胞L02,组间比较差异有差异性(F=155.50,P<0.05)。Western blot检测结果显示,组间EVA1A蛋白表达水平比较差异具有显著性(F=44.91,P<0.05);B组细胞EVA1A蛋白表达水平明显低于A组(P<0.05),D组细胞EVA1A蛋白表达水平明显高于C组(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,组间细胞荧光素酶活性比较差异有显著性(F=168.28,P<0.05),H组细胞荧光素酶活性显著低于G组(P<0.05)。划痕实验结果显示,时间、组别及其交互作用均对细胞迁移率有明显的影响(F_(组别)=335.14,F_(时间)=287.53,F_(时间*组别)=135.26,P<0.05),B组在第24、48小时的迁移率均高于A组(P<0.05),E组高于F组(P<0.05),D组低于C组(P<0.05),E组低于B组(P<0.05)。Transwell实验结果显示,A、B、E组细胞侵袭能力比较差异具有显著性(F=44.48,P<0.05),其中B组细胞侵袭能力明显高于其他两组(P<0.05)。结论miR-1250-3p可能通过抑制EVA1A的表达促进HCC细胞系QGY-7703的侵袭和迁移。