羽衣甘蓝类受体激酶FERONIA基因克隆、表达及与相互作用蛋白分析

FERONIA(FER)受体激酶在有性生殖中的花粉与柱头信号识别中发挥重要作用,为分析类受体激酶FERONIA(FER)在羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)授粉中的作用,以羽衣甘蓝自交不亲和系(S_(13-b)S_(13-b))为研究材料,采用RT-PCR从柱头中克隆得到BoFER基因,获得的BoFER cDNA序列,全长2682 bp编码893个氨基酸,其含有高度保守激酶结构域和Ser/Thr激酶结合位点。利用qRT-PCR技术对BoFER在授粉过程中的表达水平进行分析,结果发现BoFER在不亲和授粉过程其表达量逐渐升高,而在亲和授粉过程中其表达量逐渐降低。利用酵母双杂交分析BoFER与已知的自交不亲和相关蛋白的相互作用,结果显示BoFER与S位点受体激酶BoSRK13-b的激酶域存在相互作用。

芸苔属自交不亲和细胞信号转导的研究进展

在芸苔属植物的自交不亲和细胞信号转导过程中,信号分子-SCR配体是由花粉粒产生的,被柱头乳突细胞SRK受体识别后,进行细胞内信号转导。这对受体-配体是两个由S位点编码的且高度多态的蛋白质,它们决定着自交不亲和反应。配体是位于花粉粒表面的一个小的胞被蛋白,由SCR基因编码;受体是位于柱头乳突细胞原生质膜上的跨膜的蛋白质激酶,由SRK基因编码。在自交授粉过程中,配体SCR和受体SRK的相互作用激活了受体SRK,被激活的SRK通过其下游组分ARC1介导底物的泛肽化,然后泛肽化的底物在蛋白酶体/CSN中被降解,从而导致了自交不亲和性反应。这些降解的底物可能是促进花粉水合、萌发和花粉管生长的雌蕊亲和因子。主要针对芸苔属自交不亲和细胞信号转导作一综述。

配子体自交不亲和信号转导的研究进展

自然界中大多数自交不亲和(selfincompatibility,SI)显花植物表现为配子体SI。配子体SI植物虽然都具有其SI的功能而阻止自我受精,但它们采取的信号转导途径是不同的。目前关于配子体SI信号转导的途径主要有两种:一是茄科、玄参科、蔷薇科中以雌蕊SRNase为基础的信号转导途径;另一是罂粟科中以花粉管胞质自由钙离子为第二信使的转导途径。文章就配子体SI信号转导的研究进展作一综述。

羽衣甘蓝自交不亲和系的选育及S_(13b)单倍型的鉴定

该文采用亲和指数法(种子数/自交授粉花朵数)分别在羽衣甘蓝‘赤兔’和‘白波’栽培品种的自交后代中,经过3年的自交选育获得1个自交不亲和系4·1·1和一个自交亲和系3·2·3·由于在芸苔属植物F1代杂交种的生产和自交不亲和分子机制的研究方面S单倍型鉴定是必要的,因此在该文中我们采用了PCR方法利用引物PK1和PK4获得了BoSRKx的基因组序列,此序列的大小为919bp.经过数据库检索比对后发现BoSRKx的序列与BoSRK13b的序列完全一致.通过反转录PCR的方法获得了BoSRKx的cDNA序列,结果发现BoSRKx和BoSRK13b的序列在转录水平上也是完全一致的;另一方面,我们采用SCR保守信号肽编码区和NotⅠ-oligo(dT)设计的引物获得了BoSCRx的cDNA序列,经过数据库的检索比对后发现BoSCRx的序列比BoSCR13的序列只多出3个连续的碱基.根据上述结果我们推断出Sx单倍型就是S13b单倍型;最后,通过遗传分析结合PCR-RFLP方法和DNAblot方法对自交不亲和系进行了S13b纯合体的鉴定.

抗人CA19-9单克隆抗体的制备和鉴定及化学发光检测体系的建立

目的制备抗人糖抗原19-9（CA19-9）单克隆抗体（mAb）,建立双抗体夹心检测CA19-9化学发光体系。方法 CA19-9免疫小鼠后,通过细胞融合技术,获得抗CA19-9的mAb。鉴定其抗体的纯度、效价、特异性和配对,建立双抗体夹心化学发光体系。在包被缓冲液、包被浓度及加样模式上优化化学发光体系,对该体系进行准确度、最低检测限、线性、重复性评估以及血清样本的检测。结果获得4株名称为#1-1、#2-1、#3-1和#4-1的mAb。抗体效价均大于10^-8,与CA125、CA15-3、CA72-4均无交叉反应。其中#3-1 mAb与#2-1-HRP建立的双抗体夹心体系经优化后,其检测范围为0~1 000 U/mL;最低检测限为2.0 U/mL;线性相关系数为0.9999。与罗氏试剂检测结果对比,Kappa系数大于0.75;相关系数大于0.9。结论成功制备了抗人CA19-9 mAb,建立了双抗体夹心检测CA19-9化学发光体系。

抗人CA50单克隆抗体的制备、鉴定及其应用

目的制备抗人糖抗原50（CA50）单克隆抗体（m Ab）,鉴定其免疫学特性并建立化学发光免疫分析法检测体系。方法将人CA50抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选后得到稳定分泌抗CA50抗体的杂交瘤细胞株。经细胞扩大培养及纯化获得m Ab后,建立化学发光免疫分析法检测体系,并对其线性范围、准确度、灵敏度、重复性进行评估,同时进行血样的测定。结果筛选出4株抗人CA50的杂交瘤细胞株,效价均在1∶108以上,2株配对抗体不与CA125、CA153、CA199、CA724交叉。建立的化学发光免疫分析法检测范围为0~500 U/m L,回收率为107.08%,灵敏度为0.83 U/m L,重复性CV值〈10%,与参比试剂检测血样的结果比较符合率为96.7%,Kappa值为0.911。结论成功制备了抗人CA50m Ab,建立了人CA50的化学发光免疫分析法检测体系。

羽衣甘蓝泛素结合酶ubc7基因分离、原核表达及纯化

为分离羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)自交不亲和系(S13-b S13-b)泛素结合酶7(ubc7)基因,探讨Ubc7重组蛋白的原核表达及纯化。利用CTAB的方法提取羽衣甘蓝柱头总RNA,通过RT-PCR的方法分离ubc7基因,将编码ubc7基因的cDNA序列亚克隆到pET-14b原核表达载体中,将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,利用IPTG进行诱导表达,并通过Ni2+-NTA树脂进行亲和层析的方法纯化重组蛋白。结果表明,获得的Boubc7含有一个长度为501 bp的开放读码框,编码一个含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测BoUbc7的相对分子质量约为18.7 kDa,理论等电点(pI)为5.35。利用IPTG诱导的细菌蛋白中,SDS-PAGE显示出在分子量大小23 kDa处有蛋白特异性的表达,这与预测的His6融合的BoUbc7蛋白分子量相符;利用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析纯化后,成功获得了BoUbc7融合蛋白。该试验分离了羽衣甘蓝ubc7基因,并通过原核表达系统获得了BoUbc7重组蛋白,为进一步分析其生物学功能奠定了基础。

羽衣甘蓝S_(13-b)位点受体激酶基因的克隆及激酶结构域的原核表达

目的:分离羽衣甘蓝S13-b位点受体激酶(SRK13-b)基因并进行序列及结构域分析,构建SRK13-b结构域的原核表达载体并进行重组蛋白质的原核表达和纯化。方法:提取羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系花期柱头的RNA,用RT-PCR法分离SRK13-b基因;将编码SRK13-b激酶结构域的序列插入大肠杆菌表达载体pET-14b中,构建原核表达质粒pET-SRK13-bCT,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株,经0.1mmol/LIPTG诱导,用Ni-NTA亲和层析柱对SRK13-b激酶结构域蛋白进行纯化。结果:分离获得羽衣甘蓝SRK13-b基因的长度为2571bp,编码856个氨基酸,GenBank收录号为EU180597;对SRK13-b激酶结构域蛋白进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE显示相对分子质量约43×103的蛋白质特异表达,对表达产物进行分离纯化,获得了SRK13-b激酶结构域的融合蛋白。结论:羽衣甘蓝SRK13-b基因的克隆及激酶结构域的原核表达,为研究SRK的功能及自交不亲和性奠定了基础。

羽衣甘蓝不同组织及柱头发育实时荧光定量PCR内参基因的筛选

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)S_(13-b)S_(13-b)自交不亲和系为试材,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术检测Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候选内参基因在不同组织和5个不同发育时期柱头的表达情况,并运用ge Norm和Best Keeper软件统计分析候选内参基因的表达稳定性。在不同组织中,ge Norm软件统计分析的结果表明Tub-α6和EF-1β的表达较稳定;Best Keeper软件统计分析的结果表明Ubc7和Tub-α6的表达较稳定。在不同发育柱头中,ge Norm软件统计分析的结果表明Actin和Ubc7的表达较稳定;Best Keeper软件统计分析的结果表明EF-1β和Tub-α6的表达较稳定。以筛选到的内参基因Tub-α6和Actin,分别分析羽衣甘蓝柱头S-位点糖蛋白基因(SLG)在不同组织和不同发育时期柱头的表达水平,结果显示出SLG主要在柱头中表达,而且SLG在柱头发育成熟时期表达量达到最高。

泛素/26S蛋白酶体途径与显花植物自交不亲和反应

植物的生长和发育离不开短命调控蛋白的有选择性降解,其中一种重要的降解方式就是泛素/26S蛋白酶体途径。在这个途径中,泛素(ubiquitin)和26S蛋白酶体起着至关重要的作用,需要被降解的蛋白会通过E1-E2-E3酶接合反应由Ub进行标记,随后标记蛋白会被26S蛋白酶体识别并降解。自交不亲和反应也正是通过此途径实现的,ARC1(armrepeatcontaining1)和SCFs(skp1-cul1-F-box-proteins)作为E3s分别在孢子体自交不亲和和配子体自交不亲和反应中起作用。本文综述了就泛素/26S蛋白酶体途径的组成及其在自交不亲和反应中的作用。

抗人CA15-3单克隆抗体的制备、鉴定及化学发光检测体系的建立

目的获得抗人CA15-3单克隆抗体（mAb），建立CAl5-3双抗体夹心化学发光检测体系。方法人CAl5-3糖抗原免疫小鼠后，通过细胞融合，筛选到阳性杂交瘤细胞。杂交瘤细胞扩大培养后，纯化获得抗CAl5-3的mAb。对抗体进行纯度、效价、表位和亚型的鉴定并建立双抗体夹心检测CAl5—3化学发光体系，对该体系进行准确度、最低检测限、线性、重复性与特异性评估。结果获得5株阳性信号较强的杂交瘤细胞（分别为#3-1-3、#5-2-2、#11-2-2、#12—1—3和#16-1-3）。其分泌的抗体效价均大于10qg／mL，轻链均为K链，重链#3—1-3为IgG2a、#5-2-2与#12-1-3为IgG2b、#11-2-2与#16—1-3为IgG3。双抗体夹心体系在（0。300）U／mL范围内线性关系良好，其准确度的回收率为97．45％；最低检测限为0．59U／mL；线性相关系数为0．9978；低高值的变异系数（cy）均小于10％；与肿瘤标志物AFP、CEA、CAS0、CAl9-9和CA72-4均不交叉。结论成功制备了抗人CAl5-3mAb，建立了双抗体夹心检测CAl5-3化学发光体系。

抗人Apo B_(100)单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗人载脂蛋白B100(Apo B100)单克隆抗体(mAb),建立人Apo B100双抗体夹心ELISA检测方法。方法:将人Apo B100抗原免疫小鼠,通过细胞融合、筛选后得到杂交瘤细胞株。将细胞株用无血清培养基扩大培养并纯化上清获得抗体,测定抗体亲和力、亚型、特异性及表位,最后建立双抗体夹心ELISA方法。结果:获得4株抗人Apo B100的杂交瘤细胞株(4-1-2、4-2-2、4-3-2、4-6-3),其分泌的抗体不与其他相关蛋白交叉反应,亲和力达到1×109L/mol。用4-3-2和4-6-3建立的双抗体夹心法的检测范围为(1.3～80)ng/mL,灵敏度1.24 ng/mL,批内变异系数均小于10%,批间变异系数均小于15%,回收率在90%以上。结论:成功制备了抗人Apo B100mAb,建立了定量检测人Apo B100的双抗体夹心ELISA方法,为Apo B100检测及疾病的诊断奠定基础。

双色红外荧光技术在蛋白磷酸化检测中的应用

目的通过与化学发光法比较,了解双色红外荧光技术在目标蛋白磷酸化检测中的优势。方法分别取内毒素休克小鼠不同时间肺组织,制备组织匀浆蛋白样品。用SDS-PAGE电泳分离后转膜,将膜分别与磷酸化的或／和总的 p42／44 MAPK抗体孵育,二抗用耦联有Alexa Fluor 680和IRDye 800的荧光抗体或辣根过氧化物酶抗体,通过双色红外荧光系统和化学发光法进行蛋白质磷酸化检测。结果红外荧光检测技术和化学发光检测结果均显示内毒素处理后小鼠肺组织p42／44 MAPK磷酸化水平发生了改变,1 h最高,12 h以后逐渐恢复到接近正常水平。两种方法检测结果显示了较好的一致性,相比之下双色红外荧光技术具有更高的灵敏度、操作方便、节省时间及可以同时检测两种蛋白等优点。结论双色红外荧光技术在蛋白磷酸化的检测方面具有较好的应用前景。

抗HBsAg表位单克隆抗体的制备及HBV血清型夹心ELISA的建立

目的制备抗乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)表位单克隆抗体(mAb),建立HBV血清型夹心ELISA检测方法。方法将HBsAg亚型蛋白分别免疫小鼠,通过细胞融合、高通量筛选ELISA(HTS-ELISA)筛选后得到杂交瘤细胞株并在无血清培养基中扩大培养。采用蛋白A对抗体进行纯化并测定抗体亲和力、亚型、特异性,最后建立双抗体夹心ELISA。结果HBsAg的亚型蛋白ad、adr及ayw分别免疫小鼠后,其血清效价达到1∶105。细胞融合及HTS-ELISA筛选后获得4株杂交瘤细胞株。经过纯化后得到的mAb分别命名为#2-4,#18-3,#7-7,#56-5,亲和力都在1×109L/mol以上。间接ELISA结果显示,#2-4,#18-3,#7-7,#56-5分别特异性地与HBsAg的"d,y,r,w"表位结合。用抗HBsAg"a"表位的mAb#3-11分别与这4株抗体组合,进行夹心ELISA检测。结果显示,不同的ELISA组合能特异性地检测HBsAg的"d,y,r,w"表位。结论成功制备了亲和力高、特异性好的抗HBsAg 4个表位的mAb,建立了检测HBV血清型的双抗体夹心ELISA。

植物U-box／ARM蛋白

文章介绍了高等植物特有的U-box/ARM蛋白在结构、植物自交不亲和性、抗病性和激素信号转导等方面的研究进展。

羽衣甘蓝类蛋白质二硫键异构酶PDIL1-2的基因克隆及蛋白表达分析

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)为试材,利用RT-PCR和RACE的方法从柱头中分离类蛋白质二硫键异构酶BoPDIL1-2基因。将BoPDIL1-2编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到大肠杆菌中进行原核表达与纯化;用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备BoPDIL1-2多克隆抗体;通过免疫印迹法检测BoPDIL1-2在不同组织及不同发育阶段柱头的表达情况。氨基酸序列比对分析结果显示,羽衣甘蓝BoPDIL1-2与油菜BnPDIL1-2、拟南芥AtPDIL1-2的一致性分别是97.3%和85.5%。SDS-PAGE结果显示,在分子量58 kD处有BoPDIL1-2蛋白特异性地诱导表达。免疫印迹结果显示BoPDIL1-2在羽衣甘蓝柱头中特异表达,而且在柱头发育早期表达量较低,在开花期柱头表达量较高。

植物增殖细胞核抗原的结构与功能

增殖细胞核抗原(PCNA)是真核生物细胞中一类保守蛋白,在DNA复制、DNA修复及细胞周期调控过程中具有非常重要的作用。我们简要介绍植物PCNA的结构、表达调控及其功能的研究进展。

研究生功能蛋白质组学课程教学改革与探索

功能蛋白质组学是生命科学学院学术研究生的一门重要的专业选修课。为了满足新时代对研究生创新能力培养的需求,结合教学实践与思考,该文梳理总结该课程中采用的教学内容、教学方法与手段和考核方式等方面的改革办法,以期为生命科学相关专业功能蛋白质组学的课程教学与改革提供思路。

羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

目的:构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库。方法:以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为材料,提取柱头的总RNA,用亲和层析法分离纯化mRNA,利用CytoTrapXR建库试剂盒构建羽衣甘蓝柱头cDNA文库。结果:羽衣甘蓝柱头cDNA原始文库的库容量为2.5×105;扩增后文库的库容量约为4×108,重组率为96%,插入片段大小为0.4～3kb,平均长度在0.8kb左右。结论:构建了应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝自交不亲和系柱头的cDNA文库,为探讨芸苔属植物自交不亲和的分子机理奠定了基础。

人DJ-1蛋白在NIH3T3细胞中的表达与定位

采用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）示踪的方法,研究人DJ-1蛋白在真核细胞中的定位及其对刺激的反应.将克隆在pGEX-KG上的DJ-1亚克隆到载体pEGFP-C2上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染NIH3T3细胞;并用荧光显微镜观察pEGFP-DJ-1在细胞内的定位以及在血清刺激时的移位;探讨在氧化应激时DJ-1对细胞的保护作用,以及其在细胞内定位的变化.重组质粒在NIH3T3细胞中得到高效表达,绿色荧光弥散分布于胞质、胞核中,但以胞质居多;血清刺激后,细胞中的绿色荧光从胞质移位到胞核;在200～600 μmol/L H2O2刺激下,DJ-1能有效保护细胞抵抗氧化应激,并且也能从胞质移位到胞核.上述研究结果为进一步研究DJ-1蛋白的功能提供了一个重要依据.