大鼠髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用研究

目的:探讨大鼠髓核细胞来源外泌体对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:采用贴壁法体外分离培养SD大鼠尾椎椎间盘髓核细胞和BMSCs,流式细胞术和三系分化实验鉴定BM-SCs。差速离心法分离髓核细胞外泌体,透射电镜观察其形态并使用蛋白免疫印迹(Western blot)检测其蛋白标志物CD81、Tsg101。分别使用荧光探针CM-DIO和CM-DIL标记BMSCs和髓核细胞外泌体,将两者共培养24h后在荧光显微镜下观察BMSCs对髓核细胞外泌体摄取情况。将第三代BMSCs分为三组:外泌体组,加入髓核细胞外泌体(50μg/ml);共培养组,与髓核细胞非接触式共培养;对照组,未做任何处理。分别于7、14、21d时应用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外泌体组和对照组Ⅱ型胶原(COL2A1)、蛋白多糖(ACAN)、SOX9的m RNA表达量。14d时应用qRT-PCR检测3组的COL2A1、ACAN、SOX9的m RNA表达量。结果:提取的第三代大鼠髓核细胞呈多角形或不规则形状,第三代BMSCs呈形态均一的长梭形。BMSCs高表达CD29(99.77%)、CD44(93.97%)、CD90(99.67%),低表达CD34(0.82%)、CD45(0.68%)。BMSCs成骨、成脂、成软骨诱导后染色均为阳性。透射电镜观察外泌体为30～100nm类圆形双层膜结构,其表达CD81、Tsg101蛋白,不表达Calnexin蛋白。荧光显微镜下CM-DIL标记的外泌体可被CM-DIO标记的BMSCs摄取。诱导7、14、21d后,外泌体组的COL2A1、ACAN、SOX9 mRNA表达量均显著高于对照组(P<0.05)。14d时共培养组COL2A1、ACAN、SOX9的m RNA表达量均显著高于对照组,低于外泌体组(P<0.05)。结论:大鼠髓核细胞外泌体可在体外诱导BMSCs向髓核样细胞分化,且诱导效果优于与髓核细胞的非接触式共培养,可为椎间盘组织工程提供一种有效的髓核细胞来源。

大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体对退变髓核细胞的影响

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体对退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)的影响。方法:利用全骨髓法提取SD大鼠骨髓内贴壁细胞,通过成骨、成脂、成软骨三系分化及流式细胞技术鉴定所提取细胞是否为BMSCs,鉴定成功后,收取细胞培养液上清,对上清液进行差速离心,Western-blot(WB)法测定离心沉淀物质CD63、CD81、TSG101、Calnexin蛋白表达情况,并对沉淀物进行透射电镜观察鉴定是否为外泌体。取SD大鼠尾NPCs,传代培养,通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法鉴定P6 NPCs是否较P2 NPCs产生退变;在激光共聚焦显微镜下观察BMSCs外泌体被P6 NPCs摄取情况;设置P6 NPCs为对照组,BMSCs和P6 NPCs一起培养为共培养组,直接加入BMSCs外泌体诱导P6 NPCs为实验组。培养3d、7d、10d、14d后用RT-PCR法检测3组NPCs中蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(COL2)、性别决定区Y方框9(SOX-9)、金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP1)、基质金属蛋白酶1 (MMP1)基因m RNA的相对表达量;WB法检测ACAN、COL2、SOX-9、TIMP1、MMP1对应蛋白的相对表达情况。结果:通过成骨、成脂、成软骨三系分化及流式细胞技术鉴定利用全骨髓法提取的贴壁细胞为BMSCs。BMSCs培养液上清利用差速离心法提取的沉淀物形态为直径30～100nm的圆形或椭圆形,与文献记载的经典外泌体大小吻合,沉淀物CD63、CD81、TSG101高表达,Calnexin未表达。通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法鉴定P6 NPCs较P2 NPCs产生明显退变。在激光共聚焦显微镜下观察到外泌体能够被P6 NPCs所摄取。ACAN、COL2、SOX-9、TIMP1基因mRNA的相对表达量在3d、7d、10d、14d共培养组较对照组明显升高(P<0.05),实验组较共培养组明显升高(P<0.05),共培养组和实验组组内7d较3d明显升高(P<0.05)、10d较7d明显升高(P<0.05)、14d较10d明显升高(P<0.05);MMP1基因mRNA的相对表达量在3d、7d、10d、14d共培养组较对照组明显降低(P<0.05),实验组较共培养组明显降低(P<0.05),共培养组和实验组组内7d较3d明显降低(P<0.05)、10d较7d明显降低(P<0.05)、14d较10d明显降低(P<0.05);ACAN、COL2、SOX-9、TIMP1、MMP1基因相对应蛋白质表现出同样趋势。结论:在体外实验中,大鼠BMSCs能够分泌外泌体且外泌体能够被退变NPCs摄取,外泌体能够改善退变NPCs标志基因及基因对应蛋白质的表达,可为髓核细胞退变类疾病的治疗提供一种新的思路。

偏心环锯技术在经皮内镜治疗腰椎侧隐窝狭窄症中的临床应用

目的探讨经皮内镜手术中应用偏心环锯技术治疗腰椎侧隐窝狭窄症的临床疗效及其安全性。方法回顾性分析2010年4月至2012年6月收治45例腰椎侧隐窝狭窄症患者的病历资料。男28例，女17例；年龄39～62岁，平均（49.23±23.96）岁。病变均为单节段，L4，5 25例，L 5S1 20例。均采用经皮内镜手术治疗，术中采用偏心环锯技术行关节突成形术。记录患者围手术期数据包括手术节段、手术时间、术中出血量。主要观察指标为Oswestry功能障碍指数（Oswestry disability index，ODI）及疼痛视觉模拟评分（visual analogue scale，VAS），分别于术前、术后第1天、术后1个月及末次随访时进行评估。随访期间观察包括腰椎间盘突出症复发、椎管内血肿、椎间隙感染、神经根损伤及神经根炎等术后并发症的发生。结果45例患者均顺利完成手术，无术中转为开放手术者；术中均顺利完关节突成形术，无需应用电动磨钻或其他设备，且顺利置入工作套管。手术时间45～76 min,平均（61.23±13.89）min；术中出血量10～25 ml，平均（15.02±4.33）ml。术后住院时间1～3 d，平均（2.80±1.57）d。随访时间为60～84个月，平均（73.25±8.47）个月。术后第1天ODI平均为9.34%±6.54%较术前68.06%±24.14%明显降低，但术后各随访时间点及末次随访时均无明显变化。术后第1天腰痛VAS评分平均为（1.54±0.97）分较术前（3.57±3.12）分明显较低，至末次随访时腰痛症状持续缓解；术后第1天下肢痛VAS评分平均为（1.14±0.79）分较术前（6.24±2.35）分明显降低，术后6个月内下肢痛症状持续缓解，下降至（0.54±0.23）分，至末次随访时维持良好。随访期间1例患者出现腰椎间盘突出复发（2.22%），无椎间隙感染、椎管内血肿及神经根炎等并发症。结论经皮内镜手术中应用偏心环锯技术行关节突成形术是一种安全的技术，能有效地治疗腰椎侧隐窝狭窄症。