基于CD10^(+)干细胞的诱导分化及人源抗体基因制备

目的:探讨体外CD10^(+)干细胞与VSV病毒共培养分化后,能否从分化后细胞的基因组中扩增出成熟抗体IgG重链(VH)、轻链(VL)可变区基因片段。方法:37℃培养CD10^(+)干细胞至单层细胞,B细胞扩增培养基及添加的白介素因子、VSV病毒与CD10^(+)干细胞共培养15 d,留存每天细胞上清测定IgM含量,以15 d细胞为样本抽提总RNA,反转录为cDNA,以其为模板,用单链抗体(ScFv)噬菌体抗体库构建引物扩增VH、VL。结果:利用含VSV病毒、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-21、CD40L的B细胞扩增培养基成功将CD10^(+)干细胞分化为CD38、CD138阳性浆细胞,IgM含量随时间递减,诱导15 d后成功扩增出成熟抗体IgG的370 bp VH、320 bp VL可变区基因片段。结论:成功完成了基于CD10^(+)干细胞的人源抗体基因获取,可用于各类人畜共患病病毒噬菌体抗体库构建。

抗A型产气荚膜梭菌α毒素全人源单分子抗体的表达、纯化及鉴定

目的表达及纯化抗A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源单分子抗体,并进行鉴定,以期为防治该毒素引起的各类疾病奠定基础。方法将抗A型产气荚膜梭菌全人源单链抗体(single-chain fragment variable,Sc Fv)基因与人抗体轻、重链恒定区基因以不同组合方式连接,构建多种抗产气荚膜梭菌α毒素单分子抗体重组表达质粒,于感受态E.co Li BL21(DE3)中表达,间接ELISA法检测各单分子抗体的免疫结合活性。将免疫结合活性最大的单分子抗体表达产物通过Sepharo Se 4 FF及r Protein-A FF亲和层析进行纯化,纯化产物经12%SDS-PAGE分析。结果共构建5种重组表达质粒,分别为PTS-Sc Fv-CL-CH_(2)-CH_(3)、PTS-Sc Fv-CH_(2)-CH_(3)、PTS-Sc Fv-CL-CH_(2)、PTS-Sc Fv-CH_(2)、PTS-Sc Fv-CL,经E.coli BL21(DE3)表达后,获得相应单分子抗体,分别为Sc Fv-CL-CH_(2)-CH_(3)、Sc Fv-CH_(2)-CH_(3)、Sc Fv-CL-CH_(2)、Sc Fv-CH_(2)、Sc Fv-CL,其中单分子抗体Sc Fv-CH_(2)-CH_(3)的免疫结合活性最大,A_(450)达3.9,远高于其他4种单分子抗体,浓度约为1 mg/m L,纯度约为86%。结论获得1株亲和力高、免疫原性低且具有内化活性的全人源单分子抗体Sc Fv-CH_(2)-CH_(3),为治疗性抗体的进一步深入研究奠定了基础。

抗H5N1禽流感病毒M1蛋白全人源胞内抗体的制备及纯化

目的 制备抗H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)M1蛋白全人源胞内抗体TAT-ScFv M1-mFc,并进行纯化。方法 从pET28(a)-TAT-ScFv M1质粒中通过PCR扩增目的基因片段TAT-ScFv M1,将该片段与表达载体pET32(a)-HisTag-Sumo-mFc连接,构建重组表达质粒pET32(a)-HisTag-Sumo-TAT-ScFv M1-mFc,转化大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达目的蛋白。通过金属螯合层析、Sumo酶切及亲和层析等方法对目的蛋白进行纯化,ELISA法检测抗体的亲和活性。结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确。重组蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约80 000。制备的胞内抗体具有明显结合M1蛋白的活性。结论 获得了具有亲和活性的抗H5N1AIV M1蛋白的全人源胞内抗体蛋白TAT-ScFv M1-mFc,为进一步开发针对AIV H5N1的抗体药物奠定了基础。

抗禽流感病毒(H5N1)入胞单分子抗体过表达慢病毒载体的构建及其稳转细胞株的建立

构建过表达抗禽流感病毒(H5N1)M1蛋白入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的慢病毒载体,筛选获得稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T稳转细胞株。PCR扩增目的基因,将其插入质粒pLVX-mCMV-ZsGreen1-Puro中,构建pLVX-TAT-ScFv-mFc-ZsGreen1-Puro慢病毒过表达质粒,对重组质粒进行慢病毒包装后使用转染试剂复合物转染HEK293T细胞系,并使用嘌呤霉素(Puro)筛选阳性表达细胞,经过扩大培养及裂解后,以ProteinG纯化目的蛋白并对蛋白纯品进行鉴定。Western blot检测结果显示,成功获得了稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T细胞株。ELISA、SDS-PAGE、BCA结果显示成功获得预期目的蛋白2 mL(0.39 g/L)。结果表明,本研究成功建立了稳定表达抗H5N1病毒抗体的293T细胞系,为进一步研究TAT-ScFv-mFc的功能结构奠定了基础,也同时为真核表达系统的抗体制备研究提供了参考依据。

一种真核表达的抗H5N1-M1入胞单分子抗体的生物活性评价

目的评价一种真核表达的抗H5N1-M1入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的生物活性。方法采用Western blot法及局域表面等离子共振技术(localized surface plasmon resonance,LSPR)分别检测TAT-ScFv-mFc与H5N1-M1蛋白的免疫结合活性及亲和力;CCK-8法检测TAT-ScFv-mFc对流感病毒H1N1的抑制作用;免疫荧光法检测TAT-ScFv-mFc对MDCK细胞的穿膜能力。雌性BALB/c小鼠尾静脉注射TAT-ScFv-mFc,200μL/只,共30只,于注射后5、60、120、240及360 min,断尾采血,分离血清,ELISA法检测血清效价,根据Origin 2021软件绘制的半衰期曲线计算半衰期。结果TAT-ScFv-mFc与H5N1-M1蛋白可发生特异性结合,结合数率常数(Ka)达6.67×104[1/(M*s)]。经H1N1感染的MDCK细胞的存活率随着TAT-ScFv-mFc浓度增加而逐渐升高,且呈剂量依赖性,对H1N1的复制有明显抑制作用。TAT-ScFv-mFc可在短时间内穿过MDCK细胞膜,进入细胞内,结合病毒M1蛋白,从而抑制病毒的复制和组装。TAT-ScFv-mFc在小鼠体内的半衰期为212 min。结论TAT-ScFv-mFc具有与H5N1-M1良好的免疫结合活性及亲和力,可有效抑制H1N1的复制,对MDCK细胞膜有良好的穿透能力,且在小鼠体内半衰期较长,为H5N1感染的药物治疗、疫苗研究、预防治疗奠定了基础。