日粮精粗比对舍饲育肥牦牛瘤胃菌群结构、挥发性脂肪酸及其转运载体表达量的影响

[目的]本试验以舍饲育肥牦牛为研究对象,探究日粮精粗比对舍饲育肥牦牛瘤胃代谢的影响,期望为青海牦牛规模化、产业化和现代化养殖过程中日粮精粗比调控提供参考。[方法]对15头试验牛群进行分组,分别饲喂精粗(质量)比为3∶7(A组)、5∶5(B组)、7∶3(C组)的全混合日粮(total mixed ration,TMR)。饲喂90 d后于凌晨空腹屠宰,采集瘤胃液和瘤胃上皮组织,通过16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)高通量测序、气相色谱、RT-qPCR以及Western blot试验方法,探究不同精粗比日粮饲喂下,舍饲育肥牦牛瘤胃细菌菌群结构、瘤胃发酵参数以及瘤胃上皮中挥发性脂肪酸(VFA)转运载体表达量的变化。[结果]日粮精粗比显著影响瘤胃细菌菌群结构,随着精料占比升高,在门水平上,拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋体门(Spirochaetes)和黏胶球形菌门(Lentisphaerae)相对丰度显著上升(P<0.05),厚壁菌门(Firmicutes)和软壁菌门(Tenericutes)相对丰度显著下降(P<0.05);属水平上,随着精料比例提高,理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae RC9 gut group)、克里斯腾森菌科R7群(Christensenellaceae R7 group)、Saccharofermentans、产琥珀酸菌属(Succiniclasticum)和Lachnoclostridium相对丰度显著升高(P<0.05),C组牦牛瘤胃球菌属(Ruminococcus)和拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度显著低于A组(P<0.05),B组和C组牦牛普氏菌属(Prevotella)、假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrio)和密螺旋体属(Treponema)相对丰度显著高于A组(P<0.05)。日粮精粗比对瘤胃pH值及VFA产量影响显著,精粗比上升显著下调瘤胃内容物pH值(P<0.05),乙酸浓度、乙酸浓度/丙酸浓度显著降低(P<0.05),丙酸、戊酸和总VFA浓度显著升高(P<0.05),与A、B组相比,C组丁酸和异丁酸浓度显著升高(P<0.05)。日粮精粗比对瘤胃上皮VFA转运载体表达量影响显著。随着日粮精料比例升高,腺瘤下调蛋白基因(DRA)、假定阴离子转运载体1基因(PAT1)、单羧酸转运载体1基因(MCT1)和单羧酸转运载体4基因(MCT4)在mRNA水平的相对表达量显著升高(P<0.05),而阴离子交换蛋白2基因(AE2)在mRNA水平和蛋白水平的相对表达量则显著下降(P<0.05),上述基因的蛋白表达趋势与mRNA的一致。随着日粮精粗比例升高,牦牛的生产性能,即平均日增重、饲料转化率、屠宰率也随之提高,且具有显著差异(P<0.05)。[结论]饲喂高精料日粮可提升牦牛瘤胃中非纤维素降解菌的相对丰度,使大量能量饲料和蛋白饲料快速转化为VFA,为机体供能。激活瘤胃上皮细胞中VFA转运载体,提高其表达量,加快VFA转运入血的速度,以提高脂肪代谢底物,最终达到快速育肥的效果。

警犬呼吸道和肠道细菌的鉴定及其特性分析

为了快速检测犬类动物呼吸道和消化道细菌的分布状况并研究其特性,选取南京警犬研究所部分患病警犬为试验对象,收集呼吸道、肠道分泌液,使用TaqMan探针-荧光定量PCR技术进行扩增鉴定,分离细菌后进行药敏试验、细菌侵染细胞试验并检测凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的变化。结果表明:试验犬呼吸道内以β-内酰胺酶抗性基因菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌为主要细菌,消化道内以大肠杆菌、β-内酰胺酶抗性基因菌、支原体为主流细菌;药敏试验表明肺炎克雷伯氏菌对头孢类抗生素敏感,无乳链球菌对多种抗生素敏感,经过无乳链球菌的侵染后的细胞凋亡率为4.08%,而经过肺炎克雷伯氏菌侵染后的细胞凋亡率为13.47%,侵染细胞后0~4 h炎症因子ASC显著上升。综上,TaqMan探针-荧光定量PCR技术可以快速检测出警犬呼吸道和肠道细菌,筛选出患犬呼吸道和肠道的主流菌,这些细菌对头孢类等抗生素敏感,可为兽医针对性地用药提供参考。

藏羊FecB基因多态性及其与产羔数的相关性研究

旨在揭示青海藏羊群体中绵羊多胎主效基因FecB的多态性及其与产羔数的相关性,为藏羊高繁性状的选育提供参考。以157只青海藏系绵羊为研究对象,利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,检测藏羊群体中FecB基因的单核苷酸多态性,并对FecB基因与产羔数的关系展开相关性分析。结果:藏羊中存在BB、B+和++3种基因型,基因型频率分别为0.013、0.299和0.688。期望杂合度(Ho)与观测杂合度(He)分别为0.299和0.272,多态信息含量(PIC)为0.235,处于低度多态(PIC<0.25)。卡方检验结果说明藏羊群体符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。藏羊不同基因型个体产羔数比较结果为:BB>B+>++,差异达到显著水平(P<0.05),其中BB基因型产羔数显著高于B+与++基因型,B+与++基因型之间差异不显著。以上结果表明:FecB基因对藏系绵羊产羔数存在一定影响,提示FecB可作为青海藏羊多胎性状的分子标记,且存在巨大的选择潜能。

奶牛乳与血液中酮病预警新指标的研究

[目的]酮病是高产奶牛常发的代谢性疾病,本试验旨在通过分析奶牛泌乳早期的生产性能DHI(奶牛群体改良)以及外周血的血细胞成分分析数据,阐明酮病发生与以上指标的相关性,及早预警牧场牛群酮病的发展。[方法]连续3年(2018—2020年)追踪江苏省境内某规模化牧场高产奶牛产后前3个月酮病高发期的生产性能数据,筛选出25头健康和20头酮病奶牛,进一步采集2020年产后第1个月的外周血进行血细胞分析;通过二元Logistic回归模型分析各指标对酮病的预警作用,通过受试者工作特征(ROC)分析确定各指标对酮病的预警值。[结果]奶牛生产性能的回归分析结果显示:乳脂率与酮病显著正相关,乳糖率与酮病显著负相关;奶牛血细胞成分分析结果表明:淋巴细胞数和嗜酸性粒细胞数是与酮病正相关的指标;进一步相关分析发现:鲜牛乳中乳脂率和血液中淋巴细胞数两项联合指标对奶牛酮病具有显著的预警作用,其中乳脂率的最佳分界值为4.21%,淋巴细胞数的最佳分界值为4.815×109L-1。[结论]生鲜奶中的乳脂率和外周血中的淋巴细胞数可作为奶牛产后发生酮病的预警依据,用于指导牧场及时做好调控管理。

热应激奶牛外周血淋巴细胞凋亡相关基因表达及血液学分析

用半定量RT- PCR分析日平均气温分别为37 .5°C (高温)、26. 5°C (临界高温) 和5 5°C (对照) 条件下奶牛外周血中HSP70mRNA、HSF1mRNA、Bcl 2mRNA和Bax αmRNA 基因丰度变化规律; 用流式细胞仪分析上述条件下外周血淋巴细胞所处的分裂时期(G0/G1 期, S期及G2/M期) 及淋巴细胞的凋亡率; 用全血自动分析仪分析外周血的血常规。研究发现: (1) 在37. 5°C高温条件下, HSP70mRNA 基因表达水平极显著高于26 .5°C和5 5°C条件下的表达量, 表达水平随温度降低呈下降趋势; HSF1mRNA 表达水平与HSP70mRNA 相反, 随温度降低升高, 5 5°C最高, 相对于其它两个温度条件差异显著; Bcl 2mRNA/Bax αmRNA 在26 5°C时最低, 相对于其它两个温度条件该基因的丰度差异显著; (2) 淋巴细胞凋亡率在26 5°C达到最高峰(10 60%),5 5°C下降至最低(2 7%), 差异显著; (3) 白细胞计数(White blood cell, WBC) (14 75×109/L) 和红细胞计数(Red blood cell, RBC) ( 3 .85×1012/L) 在高温37. 5°C时最低, 随温度下降而逐步上升。RBC 和血红蛋白(Hemoglobin, HGB) 在37. 5°C最低, 随温度降低逐步升高, 相对于其它两个温度差异显著; 红细胞平均血红蛋白含量(Mean corpuscular hemoglobin, MCH) 在26. 5°C最高(18 .

热应激奶牛外周血淋巴细胞凋亡和bax-α基因表达

用流式细胞记录仪检测分析奶牛在夏季 (日平均气温为 37 5℃)、夏末 (日平均气温 26 5℃) 和冬季 (日平均气温 5 5℃) 时奶牛外周血淋巴细胞DNA含量, 统计细胞所处的分裂时期及淋巴细胞的凋亡率, 并通过荧光定量PCR分析上述时期外周血淋巴细胞bax α基因mRNA表达量。结果显示: (1) G2 /M期细胞和淋巴细胞增殖指数随温度降低而呈明显的下降趋势, 5 5℃时比例最低, 相对于其他两个温度条件差异显著 (P<0 05); (2) 淋巴细胞凋亡率于 26 5℃达到最高峰 (10 60% ), 5 5℃下降至最低 (2 7% ), 差异显著 (P<0 05); (3) 在 26 5℃, bax α基因mRNA表达量最高, 与其他两个温度条件相比该基因的丰度差异显著 (P<0 05); (4) bax α基因mRNA表达量与淋巴细胞凋亡率呈明显的平行关系。提示bax基因可能参与热应激引起的淋巴细胞凋亡过程。

中国部分马、驴种质资源CYTB条形码遗传多样性分析

旨在构建我国部分马、驴细胞色素b(CYTB)基因的DNA条形码数据库,并研究其遗传多样性。以全国不同区域的8个马和3个驴品种共计149例样本为研究对象,以CYTB为候选基因,构建DNA条形码数据库,并与前期获得的细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)和16S rRNA(16S)基因的DNA条形码进行对比,对我国部分马、驴品种进行遗传多样性分析。本研究共生成了CYTB DNA条形码1 271条,经分析,CYTB、COⅠ和16S的GC含量范围分别为44.4%~47.0%、38.3%~47.0%和40.9%~42.6%。对比后发现CYTB基因拥有最多的单倍型序列,在3个基因中表现出更多的多态性位点数,且单倍型多样性更高。编码蛋白的CYTB和COⅠ基因的第3位密码子突变率更高,保守性最小,而非编码蛋白16S基因中3位密码子突变率没有显著差异。CYTB和COⅠ蛋白序列的氨基酸含量不同,CYTB中含量最多的3个氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸和苏氨酸,COⅠ为亮氨酸、甘氨酸和丙氨酸。在CYTB和16S条形码中,无论是在物种水平上还是在亚种水平上,种内和种间距离都出现重合现象,而马和驴的COⅠDNA条形码在种内/种间遗传距离上存在明显的条形码间隙,更适合进行物种进化分析。综上,构建的CYTB DNA条形码含有较多的遗传信息,结合COⅠ和16S基因进行马、驴不同水平的遗传多样性分析具有一定的可行性。

赤链蛇达氏腺内分泌细胞免疫细胞化学

目的 :研究赤链蛇达氏腺内分泌细胞类型、分布特点。方法 :用免疫细胞化学ABC法。结果 :发现赤链蛇达氏腺内有 8种物质均免疫反应阳性细胞 ,分别为 5 -羟色胺、生长抑素、P物质、胰高血糖素、胃泌素、表皮生长因子受体、上皮膜抗原及睾酮 ,以 5 HT数量最多 ,GAS细胞最少 ,各细胞分布部位也有所不同。结论 :赤链蛇达氏腺的各种内分泌细胞功能与蛇类取食习惯及其他蛇类特有生理活动相适应。

赤链蛇(Dinnodonrufozonatum)精子头部形成的电镜研究

为探讨赤链蛇精子头部形成及与其他动物的区别，用透射电镜观察赤链蛇精子形成过程中头部超微结构的变化。可分成以下４个时期：时期Ⅰ，细胞核一端凹陷形成顶体囊泡，囊泡底部出现一顶体颗粒；时期Ｉ，染色质纤维浓缩呈短丝状，顶体囊泡变扁平，顶体颗粒变大并弥散；时期ＩＩ，核进一步延长，染色质纤维进一步浓缩变长变粗。沿核纵轴方向排列有序；时期Ⅳ，染色质纤维浓缩到最大限度，电子透明的核质消失，核呈高电子致密度，顶体发育完全。

无蹼壁虎(Gekko swinhonis)卵泡发育的研究

用光镜观察了无蹼壁虎卵泡发育过程．结果显示，其卵泡有显著的季节性变化，可分两期，即卵黄形成前期及卵黄形成期．卵泡来源于胚床内的卵母细胞及其周围的卵泡细胞，其发育过程有４个主要特点：１）卵泡鞘为复层扁平上皮，内层细胞碱性磷酸酶（ＡＬＰ）阳性率为１００％；２）卵黄形成前期卵泡核出现染色体及波状核膜；３）颗粒层早期由３种细胞构成：梨状细胞、中间型细胞及小细胞；４）后期颗粒层解体，卵母细胞内出现大量的卵黄小板．

乌龟（Chimemys reevesii）精子的超微结构

用透射电镜观察了乌龟精子的形态。精子长度６５～７０μｍ，头部长１７～２０μｍ，尖而弯曲，并有以下特点：１．顶体复合体细而尖；２．核内有两条小管；３．连接段在细胞核末端形成连接领；４．中段的线粒体由９或１０层不规则的同心圆状嵴及致密中心构成。研究发现乌龟精子同海龟类、喙头类及眼镜鳄的精子构造相似；但同蜥蜴类，鸟类及哺乳类的差别较大。

蜥蜴类卵泡的卵黄形成

目的 :研究蜥蜴类卵黄形成的过程及机理。方法 :用组织学、组织化学及免疫组织化学手段研究。结果 :( 1 )无蹼壁虎的卵泡伴随着颗粒细胞发育及凋亡 ,卵黄由均质的构造转变为短丝状卵黄纤维 ,再变为由 3种卵黄小板构成的卵黄 ;( 2 )北草蜥的卵泡 ,由具致密核心囊泡状卵黄变为由 1种卵黄小板构成的卵黄 ;( 3 )无蹼壁虎卵泡鞘紧靠颗粒层的内层细胞碱性磷酸酶 (ALP)呈强阳性反应 ,梨状细胞、中间型及小细胞ALP呈弱阳性反应 ;( 4 )P53在颗粒细胞内呈胞浆分泌型 ,甲胎蛋白 (AFP)则主要分布于卵泡鞘。结论 :ALP ,AFP及P53蛋白在爬行类卵泡内表达部位及时间差异性与早期卵泡细胞与颗粒细胞分化和凋亡相关 ,颗粒细胞凋亡与解体可能启动了卵黄小板的形成。

无蹼壁虎半阴茎组织学研究

目的 :无蹼壁虎半阴茎形态学特征及意义 ;方法 :用光镜组织学及组织化学对无蹼壁虎半阴茎进行研究 ;结果 :研究发现半阴茎短且分叉 ,具以下几个特点 :①前方有舌状突起及小刺状结构 ;②有开放精沟 ,ALP(碱性磷酸酶 )反应阳性 ;③半阴茎后 1 /3具明显的海绵组织 ;④后方借纵形牵引肌与肛后囊相连。结论 :无蹼壁虎半阴茎与其他爬行动物的有一定的差异性 ,这是与它的生活习性及系统演化上所出的位置是相适用的。

虎斑颈槽蛇Duvernoy腺超微结构的研究

用透射电镜研究了一种游蛇科毒蛇虎斑颈槽蛇的Ｄｕｖｅｒｎｏｙ腺。Ｄｕｖｅｒｎｏｙ腺为分枝管状腺，腺体部分主要由分泌小管组成，分泌小管由单层柱状上皮细胞围成，上皮细胞为浆液性腺细胞。胞内有许多浆液性分泌颗粒，按其形态可分为三种类型。腺体分泌小管的基膜内有肌上皮细胞分布。腺体具单一的分泌总管开口子上颌齿后方。最后讨论了该腺体的功能及其与非游蛇科毒蛇毒腺的差异性。

乌梢蛇上唇腺及达氏腺的组织学研究

该文用光镜及透射电镜观察了４条鸟梢蛇的上唇腺及达氏腺。两腺体均具分叶，上唇腺为混合腺，其分泌部呈管泡状，由大量的粘液性细胞和少量的浆液性细胞组成。达氏腺为浆液腺，其分泌部呈分枝管状，由单层柱状上皮的浆液性细胞组成，腺体具单一导管。最后讨论了两腺体的生理功能，协同作用及达氏腺在系统演化上的意义。

牛源HSP70基因点突变、分子进化和pET32a-c(+)原核表达

设计引物PCR方法克隆了奶牛1926bp的HSP70基因,连接到pGEMR○-T Easy Vector上测序,与NCBI上的序列比对,发现开放阅读框内的点突变(941位点,T→C),致使314位L(亮氨酸)→P(脯氨酸)。DNAstar Protean分析点突变对蛋白的原核表达一、二级结构、等电点进行了分析,结果显示螺旋转角区数目增多,不规则卷曲发生轻微变化,但其它指标均不变。此外,通过DNAstar MegAlign用Clustal V方法分析HSP70家族蛋白的同源性、氨基酸残基替换频率并构建了分子进化树,结果发现碱性、酸性氨基酸(R和K)、分支的氨基酸(V和L)、极性氨基酸(S和T)等在生物HSP70分子进化中氨基酸发生替换的频率最高,HSP70可以作为研究生物系统演化的一个重要的工具。在上述基础上,在HSP70基因上、下游引物分别加上EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,构建了pET-32a-c(+)-bHSP70原核表达质粒,IPTG诱导成功得到重组牛源HSP70蛋白,293细胞和Hela细胞的体外实验表明原核表达的蛋白有抗凋亡生物活性[动物学报51(6)1080-1090,2005]。

黑眉锦蛇(Elaphe taeniura)精子的超微结构

用透射电镜观察了黑眉锦蛇的精子结构．精子总长度约６９～７５μｍ，头部弯曲呈镰刀状，长约１１μｍ，有以下几个特点：（１）复杂的顶体复合体，包括顶体帽、顶体下杆、顶体下颗粒、顶体下核帽、顶体下间隙及中央管六个部分；（２）连接段形成连接裙，裙底边膨大成锤状；（３）中段无远端中心粒，具有厚的纤维鞘，第３号与第８号双联微管外侧有直径为５０ｎｍ粗的外致密纤维。

无蹼壁虎精子头部形成的研究

本文用透射电镜观察了无蹼壁虎精子头部形成的过程。早期精细胞具有显著的高尔基复合体、线粒体集合及细胞质桥，接着高尔基体成熟面分泌出前顶体囊泡，并逐渐向核移动。以后精子形成可分四个时期：时期Ⅰ，当前顶体囊泡移至核膜时，核膜凹陷形成封闭的顶体囊泡，囊泡底部靠近核膜有一电子致密的顶体颗粒；时期Ⅱ，细胞核延长，顶体囊泡变扁平；时期Ⅲ，细胞核进一步延长，核内染色质纤维变粗并沿核纵轴方向排列有序；时期Ⅳ，精子发育成熟，核浓缩到最大限度，顶体发育完全，高尔基体退化为初级溶酶体。

无蹼壁虎（Gekkoswinhonis）精子的超微结构

本文用透射电镜观察了无蹼壁虎的精子，精子总长度约５８－６５μｍ，头部弯曲长约２３－２５μｍ，其特点：（１）顶体复合体由以下四个部分组成：顶体帽、顶体下间隙、顶体下核帽及中央管；（２）中段的轴丝复合体与线粒体鞘之间有一圈纵行的微管，称为微管鞘（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓｈｅａｔｈ），另外具有终环后隐窝；（３）主段具有厚的圆筒状纤维鞘。

黑眉锦蛇(Elaphe taeniura)精子形成的电镜观察

本文用透射电镜观察了黑眉锦蛇精子形成的过程．可分成以下四个时期：时期Ⅰ，由高尔基复合体形成前顶体囊泡，并向核移动，至核膜时，核膜凹陷形成电子透明的封闭的顶体囊泡，囊泡底部有一电子致密的顶体颗粒；时期Ⅱ，顶体囊泡变扁平，染色质浓缩成短丝状的染色质纤维，近端中心粒及鞭毛开始形成；时期Ⅲ，核内染色质纤维变粗变长，并沿核纵轴方向排列有序；时期Ⅳ，纵行微管出现，至精子释放前消失，染色质纤维浓缩到最大度而使核呈高电子致密度，终环形成，顶体发育完全，精子的其它部分也逐渐形成，最后讨论了黑眉锦蛇精子形成过程中顶体区变化与其它动物的区别，微管系统存在形式和时间的种的特异性．