人血小板内皮舒张因子合酶互补脱氧核糖核酸克隆

目的：建立人血小板互补脱氧核糖核酸（ｃＤＮＡ）文库，筛选出血小板内皮舒张因子合酶（ＮＯＳ）ｃＤ－ＮＡ克隆。方法：用新鲜血小板悬液纯化血小板，提取总核糖核酸（ＲＮＡ），以ＲＮＡ为模板合成ｃＤＮＡ，将ｃＤＮＡ连接λｇｔ１１臂，用噬菌体包装蛋白包装，然后转染宿主菌Ｙ１０９０建库。用地高辛标记探针进行杂交，挑出阳性克隆，扩增后纯化脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）。将重组ＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ酶解，电泳，并将插入片段切下，纯化得到内皮舒张因子合酶ｃＤＮＡ。结果：从血小板中获得ＲＮＡ约１．５ｍｇ，ＲＮＡ变性电泳可见较清晰的１８Ｓ和２８Ｓ条带且无ＲＮＡ降解。第一条ｃＤＮＡ链产量为１．８２μｇ，第二条链为３．７９μｇ，放射性自显影显示双链ｃＤＮＡ分子大小范围在０．５～５．０ｋｂ，大部分位于１．０～４．０ｋｂ之间。人血小板内皮舒张因子合酶ｃＤＮＡ克隆约３．０ｋｂ左右。结论：人血小板内皮舒张因子合酶ｃＤＮＡ克隆约３．０ｋｂ，与其它组织的相似。

人血小板cDNA文库的建立

为建立人血小板ｃＤＮＡ文库，作者用人新鲜血小板悬液纯化血小板，加入变性液作匀浆，经苯酚、氯仿、异丙醇等抽提ＲＮＡ，以所得ＲＮＡ为模板合成ｃＤＮＡ，并将其连接λｇｔ１１臂，用噬菌体包装蛋白“包装”，再进行连续稀释，然后将不同稀释度的噬菌体转染宿主菌Ｙ１０９０。结果：从纯化血小板２．８×１０１２中获得约１．５ｍｇＲＮＡ，其Ａ（吸光度，曾称光密度ＯＤ）２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ为１．７２１，ＲＮＡ变性电泳可见１８ｓ和２８ｓ条带，且无ＲＮＡ降解。由该ＲＮＡ合成的第一条ｃＤＮＡ链产量为１．８２μｇ，第二条ｃＤＮＡ链产量为３．７９μｇ，放射自显影显示双链ｃＤＮＡ分子大小范围在０．５～５．０ｋｂ，大部分位于１．０～４．０ｋｂ之间。基因库效价为：总效价１．５２×１０８，重组子效价１．３８×１０８，重组百分比８３．１％；克隆效率６．９０×１０８。