牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能够引起牛羊的持续感染,临床上很难对其根除,建立该病有效检测方法对净化畜群具有重要意义。本研究构建BVDV E0蛋白基因重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达,用重组的E0蛋白为包被抗原,确定抗原最佳包被浓度为5μg/mL,最佳血清稀释比为1∶10,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,酶标二抗稀释度为1∶5000,作用时间为30 min,样品临界值X+2S为0.278。该方法与IDEXX的BVDV间接ELISA试剂盒比较总符合率为86%,与口蹄疫病毒、牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副结核、牛布鲁氏菌病阳性血清无交叉反应。该检测方法能够用于BVDV抗体水平的临床检测,可为感染病畜的合理淘汰提供实验依据。

绵羊抗菌肽GNLY基因多态性分析及合成多肽的生物学功能研究

试验旨在分析绵羊抗菌肽颗粒溶素(granulysin,GNLY)基因多态性,检测合成多肽的抑菌活性和抑制肿瘤细胞活性,明确绵羊抗菌肽GNLY的生物学功能。通过对GNLY基因RT-PCR产物进行测序,分析GNLY基因多态性,推导其氨基酸序列信息合成功能区多肽,利用径向扩散试验和MIC试验检测合成多肽对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用;利用MTT试验观察合成多肽对人食管癌细胞(EC109)、人肾癌细胞(X786-0)的抑制作用。结果发现,MIC试验中浓度>250μg/mL的G16对大肠杆菌、葡萄球菌均有抑制作用;浓度≥7.82μg/mL的GS16对大肠杆菌抑制作用明显,对沙门氏菌、葡萄球菌和金黄色葡萄球菌无明显抑制作用;62.5μg/mL GC16对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,其中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用较为明显;G22对4种细菌均无明显的抑制作用。MTT试验结果表明,合成多肽G16、GS16对癌细胞无抑制作用,G22和GC16对EC109、X786-0具有显著抑制作用,其中1mg/mL G22和1mg/mL GC16对EC109生长抑制率分别为88.21%和57.21%,对X786-0生长抑制率分别为96.37%和81.87%。研究显示,合成GNLY多肽对细菌和肿瘤细胞具有一定的抑制活性,本研究结果为绵羊抗菌肽作为候选抗菌药物的开发奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白原核表达纯化及多克隆抗体的制备

原核表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白,并以此免疫动物制备多克隆抗体。对BVDV NS3蛋白的抗原决定簇氨基酸序列分析,构建重组质粒pET30a-NS3,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG诱导目的蛋白表达。选择最优诱导条件对目的蛋白进行亲和纯化,目的蛋白主要以包涵体形式表达,从而获得NS3蛋白。使用NS3蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗NS3蛋白多克隆抗体,采用ELISA方法检测多克隆抗体效价。结果显示,成功表达并纯化出BVDV NS3蛋白,制备的兔抗NS3蛋白多克隆抗体效价大于1∶128000,为建立BVDV抗体/抗原检测方法及疫苗的研究奠定了基础。

当叮当猫遇上奥特曼

3520年9月9日，对于奥特曼来说是个悲惨无比的日子。因为在这一天他收到了一封让他不能再去地球除暴安良顺便赚些生活费的下岗通知书。信是动漫电视台的台长寄来的，上面写道。

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白纳米抗体筛选及反应原性检测

通过噬菌体展示技术筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白特异性纳米抗体,验证纳米抗体反应原性。使用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,分别在第0、21、49及70天采集全血,测得抗体效价后分离全血中淋巴细胞,提取总RNA,反转录后PCR扩增目的片段。目的片段和pCANTAB5E使用限制性内切酶酶切连接后转至TG1感受态细胞中,应用噬菌体展示技术构建VHH噬菌体展示文库。再经过3轮"吸附-洗脱-筛选"后得到与BVDV-E2结合的噬菌体,用ELISA鉴定其反应性。结果获得插入率为90.8%,库容为1.02×107 CFU/mL的文库。ELISA结果和序列分析显示,得到2条与E2蛋白具有良好反应性的纳米抗体且与VHH同源性较高的序列。研究结果为BVDV的防控和新型疫苗的研制奠定基础。

牛干扰素刺激基因15的生物信息学分析

为了研究牛干扰素刺激基因15编码ISG15蛋白的结构及功能特性,笔者采用生物信息学方法对ISG15基因的开放阅读框进行分析,对ISG15蛋白的氨基酸组成、理化性质、二级结构、三级结构、互作蛋白、亲疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、抗原表位进行分析预测,选取不同动物ISG15蛋白氨基酸序列构建系统进化树。结果表明,该基因全长591bp,开放阅读框全长465 bp,编码154个氨基酸;ISG15蛋白由20中氨基酸构成,分子量为17.31 ku,等电点为6.73,属于酸性蛋白;不稳定系数为50.87,属于不稳定蛋白;二级结构分析显示,ISG15以β-折叠、无规则卷曲为主,均为31.82%;互作蛋白分析显示,ISG15与干扰素、干扰素刺激基因密切相关;ISG15是亲水蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要分布于细胞质,细胞核、线粒体、内质网内亦有分布,并预测到7个潜在抗原表位。牛ISG15氨基酸序列与同属偶蹄目的牦牛、瘤牛关系最近,与灵长目类关系最远。

零食总动员

一天晚上,我半夜从梦中醒来,听到厨房里有闹哄哄的声音。我轻轻地打开房门,蹑手蹑脚地躲在一旁看。不知道什么时候,厨房里已灯火辉煌,橱柜门大开着,所有的零食都跑到了餐桌上,餐桌宛如一个大大的舞台。

牛副结核分枝杆菌(MAP)MAP3290-1595串联蛋白的原核表达及反应原性检测报告

原核表达纯化牛副结核分枝杆菌MAP3290-1595蛋白,为检测牛副结核分枝杆菌提供了新的材料。笔者通过基因串联融合MAP3290和MAP1595基因,获得MAP3290-1595基因,并使用DNAMAN软件对MAP3290-1595基因序列进行分析;构建重组质粒pET30aMAP3290-1595,将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG诱导目的蛋白表达;使用亲和层析法对目的蛋白进行亲和纯化,从而获得MAP3290-1595蛋白;利用Western Blot方法对该蛋白进行质检。成功表达纯化出MAP3290-1595蛋白。该蛋白大小为43 k Da,浓度为0.430 mg/mL,纯度大于90%。本试验成功获得MAP3290-1595蛋白,利用Western Blot和间接ELISA法检测该蛋白的反应原性,与牛副结核阴性血清反应良好,得出该蛋白具有良好的反应原性,为建立牛副结核分支杆菌检测方法提供材料。

新疆某牛场发生病毒性腹泻病的诊断分析

笔者对新疆某规模化奶牛场发生病毒性腹泻病的诊断与治疗情况进行介绍,分析了牛病毒性腹泻病的发病情况及症状、剖检病理变化、诊断及诊断方法,并对防治方法进行总结,以期为养牛业中牛病毒性腹泻的诊断与防治提供参考。

两种纯化羊驼BVDV抗体血清的方法

为了纯化2种用于不同用途的羊驼牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体血清,笔者分别使用(A|')KTAavant纯化柱直接纯化和抗原偶联亲和层析纯化特异性BVDV抗体,用ELISA测定抗体效价,SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot分析抗体的特异性。结果表明,2种方法纯化的抗体特异性均较好,可根据后续具体试验选择纯化方法。