非经典型多梳抑制复合物1.6的电镜结构分析

目的·通过负染色及透射电子显微镜(电镜)技术分析非经典型多梳抑制复合物1.6(polycomb repressive complex 1.6,PRC1.6)的蛋白结构,获得人源PRC1.6七元复合物的三维轮廓信息。方法·将PRC1.6复合物中7个组分基因RNF2、PCGF6、RYBP、L3MBTL2、CBX3、E2F6和TFDP1分别克隆至N端带有6×His-3×Flag标签的pMLink载体中,利用聚乙烯亚胺瞬时转染的方式在悬浮培养的哺乳动物细胞Expi293F中表达PRC1.6七元复合物,依次使用anti-DYKDDDDK标签亲合树脂、分子筛Superdex 200 Increase 10/300 GL(凝胶过滤层析)和甘油密度梯度离心分离纯化PRC1.6复合物;通过液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)确认PRC1.6七元复合物组分;利用泛素化活性实验和电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)对复合物的体外泛素化活性以及与核小体结合亲和力进行验证;使用乙酸双氧铀进行样品制备并通过透射电镜观察蛋白样品,随后通过单颗粒重构技术对PRC1.6复合物的三维结构信息进行分析;利用UCSF Chimera软件将蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,PDB)中的目的蛋白相关原子结构模型与重构获得的PRC1.6电子密度图进行拟合,预测PRC1.6七元复合物中各亚基的定位。结果·通过真核表达、亲和层析、凝胶过滤层析和甘油密度梯度离心,以及LC-MS/MS验证,获得了纯度较高、均一性较好的PRC1.6七元复合物,且泛素化活性实验和EMSA发现该复合物在体外具有泛素化活性和核小体结合亲和力。利用负染色、透射电镜和单颗粒重构技术初步解析了分辨率约为15.2Å(1Å=10-10 m)的PRC1.6七元复合物的三维结构,将已有RNF2、PCGF6、RYBP、L3MBTL2、CBX3和DP1部分氨基酸序列的原子模型以及E2F6的AlphaFold2预测结构与重构获得的电子密度图进行匹配,初步确认了7个亚基在PRC1.6复合物三维结构中的定位情况。结论·使用负染色和透射电镜,以及单颗粒重构技术搭建了人源PRC1.6七元复合物的三维结构模型。