中华蜜蜂细胞色素P450基因及其全长转录本的鉴定及分析

【目的】利用纳米孔(nanopore)测序技术鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道中细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)基因及其全长转录本,为后续功能研究提供参考信息和基础。【方法】通过Nanopore PromethION平台对中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道进行转录组测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行质控以得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。使用BLAST工具将上述全长转录本的序列比对到Nr和GO数据库以鉴定CYP450基因及其全长转录本。采用Astalavista软件鉴定基因的可变剪接(alternative splicing,AS)事件。通过RT-PCR验证不同类型AS事件的可靠性。【结果】在中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中分别测得7338627,7003419和7434233条原始读段,经质控得到的有效读段数分别为7289494,6959880和7387756条。鉴定到的非冗余全长转录本总数为48200条。共鉴定到47个CYP450基因和265条CYP450基因全长转录本。共鉴定到CYP450基因的90次AS事件,包括36次外显子跳跃事件、20次可变5′端剪接位点事件、17次内含子保留事件、9次可变3′端剪接位点事件及8次外显子互斥事件。RT-PCR结果证实随机选取的3种AS事件类型真实可靠。【结论】鉴定了中华蜜蜂的CYP450基因及其全长转录本,补充了东方蜜蜂参考基因组的相关注释,并揭示中华蜜蜂CYP450基因可通过多种AS类型产生丰富的剪接体。

意大利蜜蜂工蜂中肠SNP和InDel突变位点的挖掘及分析

本研究利用已获得的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的转录组数据对意蜂的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)和插入缺失(Insertion-Deletion, InDel)突变位点进行挖掘和分析,共鉴定到232 678个SNP位点,其中发生转换和颠换的SNP位点数分别为196 087和36 591个;最丰富的突变类型是G/A,最少的突变类型为T/G;分布在内含子的SNP位点最多,其次为外显子和基因间区;密码子突变类型为同义突变的SNP位点数最多,其次是非同义突变、终止子增加和终止子减少;此外,SNP位点所在基因可注释到50个GO条目和351条KEGG通路。共鉴定到38 715个InDel位点,最丰富的突变类型为移码插入,其次是移码缺失;分布InDel位点数较多的基因组区域为内含子和基因间区;另外,InDel位点所在基因可注释到50个功能条目和340条通路。研究结果丰富了西方蜜蜂Apis mellifera的SNP和InDel位点信息,并为开发和利用意蜂的新型分子标记提供基础。

过表达和敲减ace-miR-3720对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的靶基因表达和重量的影响

【目的】本研究旨在明确ace-miR-3720在中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道发育中的功能,并为进一步探究ace-miR-3720调控肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ace-miR-3720的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-miR-3720和抑制物inhibitor-miR-3720,通过饲喂中华蜜蜂工蜂幼虫对ace-miR-3720分别进行过表达和敲减。采用RT-qPCR检测过表达和敲减ace-miR-3720后4-6日龄幼虫肠道内ace-miR-3720及其靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的相对表达量;使用分析天平称重过表达和敲减ace-miR-3720后的幼虫肠道重量。【结果】相较于无义模拟物(nonsense mimic,mimic-NC)组,mimic-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在中华蜜蜂4和5日龄幼虫肠道中均极显著上调,在6日龄幼虫肠道中显著上调;相较于无义抑制物(nonsense inhibitor,inhibitor-NC)组,inhibitor-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在4日龄幼虫肠道中极显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调。ace-miR-3720与基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1之间存在潜在靶向关系。与mimic-NC组相比,mimic-miR-3720组中CKⅠ表达量在4和5日龄幼虫肠道中皆极显著下调,在6日龄幼虫肠道中显著下调;MAPK1表达量在4日龄幼虫肠道中显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中均极显著下调;βGBP1表达量在4日龄幼虫肠道中显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中均极显著下调;此外,4和5日龄幼虫肠道重量均极显著降低,6日龄幼虫肠道重量显著降低。与inhibitor-NC组相比,inhibitor-miR-3720组中CKⅠ表达量在4-6日龄幼虫肠道中皆极显著上调;MAPK1表达量在4日龄幼虫肠道中显著上调,在5和6日龄幼虫肠道中极显著上调;βGBP1表达量在4和6日龄幼虫肠道中显著上调,在5日龄幼虫肠道中极显著上调;此外,4和6日龄幼虫肠道重量显著升高,5日龄幼虫肠道重量极显著升高。【结论】ace-miR-3720在中华蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物可对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道内分别实现miRNA的有效过表达和敲减;ace-miR-3720可能通过调控CKⅠ,MAPK1和βGBP1的表达影响中华蜜蜂工蜂幼虫肠道重量并参与幼虫肠道发育。

基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌SNP与InDel位点发掘及分析

【目的】本研究拟利用已获得的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝的PacBio单分子实时(single molecule real-time,SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和插入缺失(insertion-deletion,InDel)突变位点进行发掘和分析,旨在丰富蜜蜂球囊菌的SNP和InDel位点信息,并为新型分子标记的开发和应用提供基础。【方法】采用SAMtools对蜜蜂球囊菌菌丝PacBio SMRT测序数据进行全长转录本识别,再利用ANNOVAR软件将识别的全长转录本与蜜蜂球囊菌参考基因组(assembly AAP 1.0)进行比对以检测和分析SNP位点和InDel位点。通过相关生物信息学软件将上述SNP位点和InDel位点基因分别比对GO和KEGG数据库进行功能和通路注释。【结果】在蜜蜂球囊菌菌丝中共鉴定到6743个SNP位点,主要分布于外显子,包括6091个纯合位点和652个杂合位点;其中发生转换和颠换的SNP位点分别有4887和1856个;SNP位点密码子突变类型中数量最多的是同义单核苷酸突变;SNP位点基因可注释到34个GO条目和76个KEGG通路。共鉴定到597个InDel位点,包括349个纯合位点和248个杂合位点,这些InDel位点在基因下游区分布的数量最多;InDel位点密码子突变类型中非移码插入最为丰富;InDel位点基因可在39个GO条目和87条KEGG通路。【结论】鉴定到蜜蜂球囊菌的大量SNP和InDel位点,明确了SNP和InDel位点的突变类型、基因组功能元件分布和密码子突变类型,并揭示了SNP和InDel位点与关键生物学过程的潜在关联。

东北地区东方蜜蜂遗传分化和多样性分析

调查我国东北地区东方蜜蜂Apis cerana,分析其遗传分化并探讨隔离机制,明确东北东方蜜蜂种群遗传特征和多样性水平,探究蜜蜂种群遗传分化和遗传多样性相关规律,建立并完善东方蜜蜂种群遗传学。利用33个形态标记和38个微卫星DNA标记,对东北7个样点共461群东方蜜蜂及北京平谷、浙江金华、四川平昌、海南儋州外群作遗传分化、遗传特征和遗传多样性分析。形态标记、微卫星DNA标记分析结果均显示,分布于长白山山脉抚松、安图、敦化、本溪、宽甸东方蜜蜂聚为同一种群。长白山种群肘脉指数、翅长、第五背板绒毛带长、第四腹板长等形态指标数值较高。微卫星各位点等位基因以1、2种为主,频率达80%以上的21个。遗传多样性结果显示,长白山种群的观察杂合度、有效等位基因数、多态信息含量等数值较低。东北地区东方蜜蜂主要分布在吉林、辽宁长白山山区,形成长白山东方蜜蜂种群。该种群与北京、四川、浙江、海南东方蜜蜂发生明显遗传分化,遗传多样性水平较低。分化主要原因为辽宁省长白山以西平原地区,东方蜜蜂逐渐消失,基因流阻断。长白山东方蜜蜂种群遗传多样性水平较低,环境和人为因素导致种群数量减少。

利用第三代纳米孔长读段测序技术构建和注释蜜蜂球囊菌的全长转录组

【目的】利用第三代纳米孔(nanopore)长读段测序技术对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)的纯化菌丝(Aam)和孢子(Aas)进行测序,构建和注释球囊菌的高质量全长转录组。【方法】通过Oxford Nanopore PromethION平台对Aam和Aas进行测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行碱基识别(base calling),通过过滤短片段和低质量原始读段得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。通过比对Nr、Swissprot、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG数据库获得全长转录本的注释信息。分别利用CPC、CNCI、CPAT、Pfam 4种方法对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)进行预测,取四者的交集作为高可信度的lncRNA。【结果】Aam和Aas的纳米孔测序分别测得6321704和6259727条原始读段,经质控得到5669436和6233159条有效读段,其中包含的全长有效读段分别为4497102(79.32%)和4963101(79.62%)条。共鉴定到9859和16795条非冗余全长转录本,N50分别为1482和1658 bp,平均长度分别为1187和1303 bp,最大长度分别为6472和6815 bp。Venn分析结果显示有6512条非冗余全长转录本为菌丝和孢子所共有,分别有3347和10283个非冗余全长转录本为二者特有。此外,在球囊菌菌丝和孢子中共鉴定到20142条全长转录本,其中分别有20809、11151、17723、12164、11340和9833条全长转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG数据库。注释全长转录本数量最多的物种是球囊菌、Polytolypa hystricis和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。GO数据库注释结果显示,上述全长转录本可注释到45个功能条目,涉及细胞组件、细胞和细胞器等细胞组分相关条目;催化活性、结合和转运器活性等分子功能相关条目;以及细胞进程、代谢进程和单一组织进程等生物学进程相关条目。KEGG数据库注释结果显示,上述全长转录本还可注释到抗生素的生物合成、核糖体、氨基酸的生物合成、碳代谢和剪接体等49条通路。此外,鉴定到648条高可信度的lncRNA,包含480条基因间区lncRNA、119条反义链lncRNA和49条正义链lncRNA。【结论】构建和注释了球囊菌的首个高质量全长转录组,为探究球囊菌转录组的复杂性,完善参考基因组的序列和功能注释信息以及深入开展球囊菌可变剪接体的功能研究提供了关键依据。

样本量与东方蜜蜂微卫星DNA遗传多样性参数稳定性的关系

准确地评估遗传多样性是研究遗传多样性和保育遗传学的重要前提.遗传多样性研究可靠性的影响因素之一就是采样策略中的最适样本量.本研究采用微卫星标记研究样本量对遗传多样性参数检测稳定性的影响.以5个东方蜜蜂种群为试验材料,设置10群为样本梯度,10~150群共15个梯度样本量,分析微卫星标记常用的7个遗传多样性参数与样本量之间的关系.结果表明:(1)每个参数反映的遗传多样性信息不同,能反映总体遗传多样性所需要的样本量也不同.(2)反映种群遗传变异丰富度的等位基因数和等位基因丰富度极易受样本量的影响,样本量为150群时能检测到总体91%以上的丰富度;反映种群遗传变异均匀度的期望杂合度、观察杂合度、有效等位基因数和多态信息含量的最小样本量分别为40、70、40和60~80群;同时反映遗传丰富度和均匀度的香农指数最小样本量为60~70群.综合考虑所有参数,建议在充分保证样本代表性的前提下,研究蜜蜂遗传多样性的样本量最少60群,最好在80群以上;重点关注等位基因数和等位基因丰富度等参数的研究,样本量应在150群以上;重点关注期望杂合度和有效等位基因数的研究,样本量可在40群以上.

基于纳米孔全长转录组数据完善东方蜜蜂微孢子虫的基因组注释

【目的】利用已获得的纳米孔全长转录组数据对现有的东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)参考基因组的基因序列和功能注释进行完善。【方法】采用TransDecoder软件预测东方蜜蜂微孢子虫基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)及相应的氨基酸。利用gffcompare软件将全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,对基因组注释基因的非编码区向上游或下游延伸,修正基因的边界。利用MISA软件鉴定长度在500 bp以上的全长转录本的简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)位点,包括单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复、混合SSR等类型。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库,从而获得功能注释。【结果】共预测出2 353个完整ORF,其中长度分布在0—100个氨基酸的ORF最多,占总ORF数的72.12%。共对东方蜜蜂微孢子虫的2 340个基因进行了结构优化,其中5′端延长的基因有1 182个,3′端延长的基因有1 158个。共鉴定到1 658个SSR,其中单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复的数量分别为1 622、23、7和6个;单核苷酸重复类型的SSR密度最大,达到182.32个/Mb,其次为混合SSR、双核苷酸重复和三核苷酸重复,分别达到6.90、2.78和0.73个/Mb。共鉴定出954个新基因,其中分别有951、333、371、422和321个新基因可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。此外,还鉴定出6 164条新转录本,其中分别有6 141、2 808、2 932、3 196和2 585条新转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。新基因和新转录本注释数量最多的物种均为东方蜜蜂微孢子虫,其次是蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)。【结论】研究结果较好地完善了现有的东方蜜蜂微孢子虫参考基因组已注释基因的序列和功能注释,并补充和注释了大量参考基因组未注释的新基因和新转录本。

微小RNA介导意大利蜜蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的跨界调控

【目的】东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)感染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)导致蜜蜂微孢子虫病。本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据,通过生物信息学方法对意蜂工蜂中肠的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)靶向结合的东方蜜蜂微孢子虫的mRNA和差异表达mRNA(DEmRNA)进行预测、数据库注释和调控网络分析,以期在组学水平解析miRNA介导意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的跨界调控机制。【方法】通过比较东方蜜蜂微孢子虫侵染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠(AmT1、AmT2)和未受侵染的工蜂中肠(AmCK1、AmCK2)的miRNA组学数据筛选出宿主的显著性DEmiRNA,通过比较侵染意蜂工蜂中肠的东方蜜蜂微孢子虫(NcT1、NcT2)和东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子(NcCK)的mRNA数据筛选出病原的DEmRNA。利用TargetFinder软件预测宿主显著性DEmiRNA靶向结合的病原mRNA和DEmRNA。利用相关生物信息学工具对上述靶DEmRNA进行GO和KEGG数据库注释。结合前期研究结果筛选出孢壁蛋白、极管蛋白、蓖麻毒素B凝集素、ABC转运蛋白、ATP/ADP移位酶和糖酵解/糖异生途径等毒力因子和能量代谢通路相关的病原DEmRNA及与其存在靶向结合关系的宿主显著性DEmiRNA,并构建和分析二者的调控网络。【结果】AmCK1 vs AmT1比较组中宿主的48条显著上调miRNA和36条显著下调miRNA分别靶向病原的1345和1046条mRNA;进一步分析发现,宿主的47条显著上调miRNA和34条显著下调miRNA可分别靶向NcCK vs NcT1比较组中病原的584条显著下调mRNA和265条显著上调mRNA,它们可分别注释到19和22个功能条目以及66和64条通路。AmCK2 vs AmT2比较组中宿主的56条显著上调miRNA和51条显著下调miRNA分别靶向病原的1260和1317条mRNA;进一步分析发现,宿主的52条显著上调miRNA和49条显著下调miRNA可分别靶向NcCK vs NcT2比较组中病原的587条显著下调mRNA和336条显著上调mRNA,它们可分别注释到20和23个功能条目以及64和65条通路。AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组的8条共同显著上调miRNA和1条共同显著下调miRNA分别靶向NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中的144条共同显著下调和10条共同显著上调mRNA,可分别注释到18和13个功能条目以及38和7条通路。此外,AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组中宿主的显著上调miRNA可靶向结合NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中与RNAi途径,孢壁蛋白和蓖麻毒素B凝集素等毒力因子,糖酵解/糖异生途径以及MAPK信号通路相关的病原下调表达mRNA。【结论】在东方蜜蜂微孢子虫的侵染过程中,意蜂工蜂中肠的DEmiRNA与病原的DEmRNA之间存在复杂的靶向结合关系以及潜在的跨界调控关系;宿主的DEmiRNA可能通过抑制或降解病原的RNAi途径、毒力因子、糖酵解/糖异生通路、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白及MAPK信号通路相关靶DEmRNA影响病原的侵染和增殖。

中华蜜蜂6日龄幼虫响应蜜蜂球囊菌侵染的长链非编码RNA应答研究

【目的】本研究旨在探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)6日龄幼虫应答蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)侵染过程中的差异表达谱及调控作用。【方法】利用链特异性cDNA建库的RNA-seq技术对未被侵染及球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行深度测序。通过相关生物信息学软件分析lncRNA的结构特征和表达谱。筛选并分析差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA)的顺式(cis)作用及竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络。采用RT-qPCR验证测序数据及DElncRNA差异变化趋势的可靠性。【结果】AcCK和AcT共预测出642个已知lncRNA和487个新lncRNA。与蛋白编码基因相比,上述中蜂lncRNA外显子数更少、长度更短且表达量更低。43个antisense lncRNA与40个正义链mRNA之间互补配对。AcCK和AcT比较组包含367个上调lncRNA和268个下调lncRNA。有194个DElncRNA潜在调控461个上下游基因,并涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等38个功能条目以及氨基酸代谢、内吞作用和MAPK等191条通路。此外,有180个DElncRNA可靶向结合50个DEmiRNA,进而调控6365个mRNA;三者之间形成较为复杂的ceRNA调控网络。【结论】中蜂6日龄幼虫肠道的部分lncRNA可作为antisense lncRNA参与应答球囊菌侵染;部分DElncRNA可通过cis作用调节物质代谢和免疫途径相关的上下游基因,从而介导宿主的侵染应答;TCONS_00010661和TCONS_00003104等DElncRNA可通过ceRNA网络调控Jak-STAT和氧化磷酸化等通路及富集基因,进而参与宿主的侵染应答。

中华蜜蜂的单核苷酸多态性和插入缺失突变位点鉴定

【目的】本研究拟利用已获得的中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫肠道的转录组数据对单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)和插入缺失(Insertion-Deletion,InDel)突变位点进行挖掘和分析,旨在丰富中华蜜蜂的SNP和InDel信息,并为新型分子标记的开发提供基础。【方法】根据有效读段与东方蜜蜂Apis cerana参考基因组的比对情况,采用GATK软件识别单碱基错配和碱基的插入缺失情况,再利用ANNOVAR软件对SNP位点和InDel位点进行分析。通过相关生物信息学软件将SNP和InDel位点所在基因分别比对GO和KEGG数据库,以获得相应的功能和通路注释。【结果】共鉴定到中华蜜蜂的58 919个SNP位点,包括24 548个纯合位点和34 371个杂合位点;发生转换和颠换的SNP位点分别有49102和9817个;数量最多和最少的突变类型分别是C/T和T/G;分布在外显子区的SNP位点数量最多,达到22 649个;此外,发生同义突变的SNP位点数量最多,其次是非同义突变;SNP位点所在基因可注释到46个GO条目和121条KEGG通路。共鉴定到6 551个InDel位点,包括3 270个插入突变和3 281个缺失突变;分布在内含子区InDel位点最多,共计2 793个;发生移码插入的InDel位点最多;进一步分析结果显示InDel位点所在基因可注释到27个GO条目和28条KEGG通路。【结论】本研究鉴定到中华蜜蜂的大量SNP位点和InDel位点,解析了SNP和InDel位点的突变类型、基因组功能元件分布和密码子突变类型,并揭示SNP和InDel位点对中华蜜蜂的重要生物学过程具有潜在影响。

东方蜜蜂微孢子虫的SNP与InDel位点鉴定及分析

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是一种专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌病原,广泛感染世界各地的蜂群。本研究拟利用已获得的东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子的高质量转录组数据进行单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)和插入缺失(Insertion-Deletion,InDel)位点的鉴定和分析,旨在丰富东方蜜蜂微孢子虫的SNP和InDel信息,并为新型分子标记的开发提供基础。【方法】使用GATK软件识别东方蜜蜂微孢子虫的SNP和InDel位点。采用SnpEff软件预测变异位点发生的基因组区域及变异产生的影响。通过相关生物信息学软件分别将SNP和InDel位点所在基因分别比对GO和KEGG数据库,获得相应的功能和通路注释。【结果】共鉴定到28195个SNP位点,其中发生转换和颠换的SNP位点分别有21403和6792个;上述SNP位点的突变类型有12种,其中最丰富的突变类型为C/T;分布在CDS区的SNP位点最多,其次是基因间区、上游区、下游区和内含子区;最丰富的密码子突变类型是同义突变;SNP位点所在基因可注释到代谢进程、细胞组分和催化活性等43个GO条目以及代谢途径、核糖体和等次生代谢产物的生物合成等85条KEGG通路。共鉴定到2831个InDel位点,其中分布在基因间区InDel位点最多,分布在CDS区的InDel位点最少;最丰富的密码子突变类型是移码突变;InDel位点所在基因可注释到细胞进程、细胞和结合等38个GO条目以及代谢途径、次生代谢产物的生物合成及核糖体等73条KEGG通路。【结论】东方蜜蜂微孢子虫中存在大量的SNP和InDel位点,SNP位点的突变类型主要为转换,与其他物种类似;SNP与InDel位点的基因组功能元件分布规律和突变类型具有明显差异;SNP和InDel位点所在基因与东方蜜蜂微孢子虫适应宿主细胞内环境及病原增殖过程具有潜在关系。