水产动物疾病学教学案例的实践应用

水产养殖专业实践性较强,涉及的水产动物疾病学课程知识体系繁多。水产动物疾病学课程是一门与生产密切相关的水产养殖本科专业必修主课程,具有极强的理论性和实践性。应用型大学人才培养突出实践能力,在本科水产动物疾病学授课中引入案例教学,提高了该课程的教学质量,增强了学生的问题分析和解决能力。文章基于案例教学在当前应用型大学教学中的重要性,在水产动物疾病学课程中实时开展案例教学,对实施效果以及存在问题进行了讨论。

溶藻弧菌诱导凡纳滨对虾消减文库的构建及其表达序列标签分析

利用抑制消减杂交技术构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)诱导的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴细胞cDNA文库。用DNAMAN5.2.2软件对560条高质量的ESTs进行聚类,共获得239个Unigenes。与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比较,其中66.9%为已知功能基因,33.1%为未知功能基因,GO分类将其分为7类,包括能量和基础代谢类相关的基因为第一大类占36%,免疫相关基因占15%,其他基因占8%,信号转导类占3%,抗氧化酶和凋亡相关蛋白均为2%,核蛋白类占1%。实验结果表明凡纳滨对虾在溶藻弧菌诱导下可产生一系列特异基因的表达,通过对文库的分析显示,基于PCR方法建立的SSH文库为取得大量免疫相关基因的ESTs序列提供了可能。

人工感染3种弧菌对鲻鱼血清酶活力的影响

【目的】了解病原菌对鲻鱼非特异性免疫功能的影响,为鲻鱼细菌性疾病的免疫防治提供参考依据。【方法】采用腹腔注射法将等比例混合浓度为4.5×106 CFU/mL的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)混合菌悬液人工感染鲻鱼,对照组注射等量灭菌生理盐水,分别在感染后第0、1、3、7、11、15、19、23、27、31和35 d采集血样测定血清中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活力的变化。【结果】鲻鱼在感染3种弧菌混合悬液后第3 d开始出现发病症状,其血清中的溶酶体酶(ACP、AKP和LSZ)活力总体上呈先降低后升高再降低的变化趋势;抗氧化酶(SOD和POD)活力也呈先降低后升高再降低的变化趋势;氨基转移酶(GOT和GPT)活力在感染初期呈急剧上升态势,而后下降回归至正常水平。【结论】鲻鱼受到外源微生物(弧菌混合悬液)刺激后,其体内非特异免疫系统被激活、组织(肝脏)受到损伤,即血清中非特异免疫酶可作为鉴定鱼体健康状况的指标。

青蟹呼肠孤病毒对拟穴青蟹的致病性研究

2008—2012年广西海洋研究所海水增养殖基地暂养的拟穴青蟹膏蟹出现"嗜睡"等典型的青蟹呼肠孤病毒病症状。采用套式PCR检测濒死膏蟹感染青蟹呼肠孤病毒阳性率为100%,经Blastn比对扩增序列与青蟹呼肠孤病毒基因(HQ414137.1)相似度达98%,属于青蟹呼肠孤病毒(JX213634)。病毒粗提液人工回感后发现,攻毒1h,青蟹血淋巴中即可检测到青蟹呼肠孤病毒;攻毒后第4～6d,出现死亡高峰,第10d,累积死亡率达到100%。血清酶指标中碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力明显高于对照组,而与免疫相关的过氧化物酶、超氧化物歧化酶活力低于对照组;肝胰腺、鳃和肌肉组织切片均呈现显著病理坏死损伤。青蟹呼肠孤病毒是此次拟穴青蟹膏蟹死亡的主要原因。

二种体色拟穴青蟹群体ISSR分析

应用ISSR分子标记技术分析二种体色拟穴青蟹群体的遗传多样性.10条ISSR引物共扩增出81条带,其中73条表现出多态性,占总条带数的90.12%.暗红色和深绿色拟穴青蟹群体的多态性位点比率分别为81.48%和77.78%,暗红色群体的Nei’s基因多样性指数(He=0.318 9)和Shannon’s信息指数(I=0.469 0)略高于深绿色群体(He=0.305 4,I=0.449 1).群体间的Nei’s遗传相似性(0.948 4)和遗传距离(0.052 9)表明,群体间遗传分化属于种内遗传分化.POPGENE和AMOVA分析表明,总的遗传变异主要来源于群体内个体间,群体间发生中等程度遗传分化,群体间存在强大的基因流.UPGMA聚类图可视化群体间和群体内的遗传变异,显示60个个体并没有按体色聚类.

卵形鲳鲹一例疑似神经性病毒病的初步分析

对疑患病毒性神经坏死症、身体失去平衡、漂浮水面螺旋状游泳、体色发黑、大规模死亡的海水网箱养殖卵形鲳鲹幼鱼,采用组织病理切片观察和分子生物学技术对其病原进行初步分析和跟踪调查。组织病理学结果显示,病鱼脑和眼均呈现神经坏死病毒典型的空泡化现象;利用神经坏死病毒特异性引物nest-PCR检测发现,病鱼一扩阳性率100%,摄食游泳正常鱼一扩和二扩阳性率均为46.67%,显示港区苗种多自身携带病毒株;序列比对显示该病毒株属于赤点石斑神经坏死病毒基因型;对神经坏死病毒跟踪发现,成鱼一扩均为阴性,二扩阳性率则高达86.7%。初步认为,外界因子可能作为诱导因子,致使本身携带病毒鱼苗免疫降低致使此次流行病爆发,且神经坏死病毒潜伏于鱼体的时间较长。

中药制剂治疗黄疸型肝炎的研究进展

黄疸型肝炎的病因为湿热蕴藉于肝胆,使肝失疏泄、气机不畅、胆汁外溢,传统的中医药在治疗黄疸型肝炎方面具有独特的优势。本文按传统和现代剂型分类介绍了近年来治疗黄疸型肝炎中药制剂的研究进展,根据中药配伍"君臣佐使"理论进行了组方分析,并探讨了今后研究的方向和重点。

拟穴青蟹ISSR-PCR条件的优化

分析DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶及甲酰胺、二甲基亚砜等对拟穴青蟹ISSR-PCR反应的影响。研究结果确定了获得清晰条带的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶的浓度范围分别为:模板DNA 8～50 ng/μl,Taq DNA聚合酶0.75～1.0 U,Mg2+1.0～2.0mmol/L(与引物密切相关),dNTP 0.15～0.20 mmol/L,引物浓度0.6～0.8μmol/L。甲酰胺的添加并不能优化拟穴青蟹ISSR-PCR反应结果,而低浓度的二甲基亚砜可提高扩增产物的清晰度,但与引物相关。

拟穴青蟹群体遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR技术对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)3个地理群体:福建群体(FJ)、广西防城港群体(FC)和北海群体(BH)的遗传多样性进行检测。用10对ISSR引物对90个个体进行PCR扩增,用POPGENE32计算遗传参数,并用ARLEQUIN软件进行AMOVA分子变异分析。结果共检测到63个位点,多态位点数为56。福建、防城港和北海群体Nei's基因多样性指数(He)分别为0.2670、0.1819和0.2257,Shannon's信息指数(I)分别为0.3945、0.2708和0.3371,遗传多样性水平从高到低依次为FJ>FC>BH。He和I在群体水平上分别为0.2248和0.3341,在物种水平上分别为0.3186和0.4337。拟穴青触32.34%的变异发生在群体间,67.66%的变异发生在群体内,3个群体间的遗传分化系数为0.1542,产生了一定的遗传分化。

一种新的获取海洋贝类基因组DNA的取样方法(摘要)(英文)

[目的]探讨一种新的获取海洋贝类基因组DNA的取样方法,为开展珍稀贝类的分子生物学研究提供参考。[方法]以文蛤、栉江瑶、翡翠贻贝、香港巨牡蛎、毛蚶为供试材料,以闭壳(合)肌全基因组DNA作为参考,采用常规酚-氯仿法抽提贝类贝腔液基因组DNA,使用生物光度计法、琼脂糖凝胶电泳、目的片段扩增测序验证其质量,并建立系统发育树检测其来源的真实可靠性。[结果]采用常规酚/氯仿基因组DNA提取方法获得的贝腔液DNA质量优于闭壳(合)肌DNA,蛋白质、多酚色素污染较少,完全满足目的片段扩增测序;系统发育进化树则证实了贝腔液并非外源污染。[结论]从贝腔液中获取基因组DNA是完全可行的,并可将其用于目的基因片段的扩增。

非伤害性取样方法获取的拟穴青蟹DNA质量研究

选取5只采自广西北海的野生拟穴青蟹（Scylla paramamosain）,分别采用非伤害性（血淋巴）和伤害性（肌肉组织）取样方法提取基因组DNA进行COI扩增和ISSR扩增,检测DNA质量。结果表明,非伤害性（血淋巴）和伤害性（肌肉组织）取样方法获得的拟穴青蟹全基因组DNA的OD260/OD280分别为1.75~2.01和1.81~1.94,全基因组DNA纯度均较高,质量不相上下。同时,两种取样方法获取的DNA扩增片段大小均在600bp左右,同一个体扩增带型也是一致的。非伤害性（血淋巴）取样方法提取的基因组DNA,在质量上可以媲美伤害性取样（肌肉组织）提取的DNA,可以用于其它分子生物学实验研究。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血淋巴cDNA文库构建及表达序列标签初步分析

利用SMART技术构建副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血淋巴cDNA文库。结果表明,该文库的滴度为1.04×107CFU/mL,文库总容量达1.144×107CFU,克隆子插入片段大小为500—2000bp,重组率达98%。将随机挑选的300个阳性克隆测序,经过质量控制和拼接,共得到141个单基因组簇(UniGenes),75个UniGenes与NCBI非冗余蛋白质数据库中登录的蛋白质序列存在显著相似性,其中20个与免疫防御相关,如kazal-like丝氨酸蛋白酶抑制剂类蛋白、kazal-type蛋白酶抑制剂arasin-like蛋白、抗内毒素因子、抗微生肽、金属硫蛋白、铁蛋白、类70kD热休克蛋白等,达总测序数的6.67%。研究结果证实,构建cDNA文库是获得拟穴青蟹免疫相关基因的可靠途径。

广西沿海裸体方格星虫群体遗传多样性及遗传分化

采用随机扩增多态DNA技术检测广西沿海裸体方格星虫4个地理群体的遗传多样性和遗传结构,10条10bp寡核苷酸随机引物扩增114个个体,分析其中的87个位点。试验结果表明,广西沿海裸体方格星虫群体间遗传多样性高低及遗传分化与天然屏障导致的地理隔离相关,裸体方格星虫的浮游幼体并不能有力地促进群体间基因交流。UPGMA聚类分析指出,广西裸体方格星虫群体至少应作为2个保育单元经营,即江平保育单元和犀牛角—西乡塘—闸口保育单元。

广西茅尾海常见牡蛎的分子鉴定

应用COⅠ条形码技术鉴定广西茅尾海的3种常见牡蛎,其俗名分别是"白眼蚝"、"红眼蚝"和"蚝砺"。研究结果表明,茅尾海3种牡蛎应归属牡蛎科(Ostreidae)、巨蛎属(Crassostrea),其中"白眼蚝"是香港巨牡蛎(C.hongkongensis)、"红眼蚝"是有明巨牡蛎(C.ariakensis)、"蚝砺"是Kumamoto牡蛎(C.sikamea)。研究验证了已开发的多重PCR技术能对3种牡蛎进行快速鉴定,并揭示香港巨牡蛎是茅尾海优势种,基本上澄清了与"近江牡蛎"相关的俗名问题。

广西养殖拟穴青蟹携带病原体状况的初步调查

采用微生物分离培养技术和巢式PCR技术相结合方法对2011年采自广西北海南万和古城、钦州茅岭和钦州港、防城港企沙和公车的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)携带寄生虫、细菌和病毒状况开展调查。寄生虫检测结果显示,仅钦州茅岭拟穴青蟹鳃组织中发现寄生虫茗荷(儿)。细菌性病原体检测结果显示,共有11种病原性细菌存在于健康养殖拟穴青蟹体内,弧菌属细菌性病原出现频率最高,其中副溶血弧菌和溶藻弧菌在调查区域内均有分布,其他菌种则呈现一定的地域特异性。病毒性病原体检测结果显示,白斑综合症病毒仅在钦州茅岭拟穴青蟹检出,阳性率为4.94%;双顺反子病毒于北海古城和钦州茅岭拟穴青蟹检出阳性携带率为3.70%;呼肠孤病毒携带率则较高,北海、防城港以及钦州拟穴青蟹均有检出,阳性率达25.93%。由此可见,10-11月广西区内健康养殖拟穴青蟹携带弧菌和呼肠孤病毒的比例远远高于其他病原体,为拟穴青蟹携带的主要病原体。

拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件的优化

旨在优化拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件。克隆拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因成熟肽片段,与p ET-28a表达载体连接后,转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,通过优化条件进行诱导表达。结果显示,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.2 mmol/L、37℃条件下培养4 h后表达量最大,分子大小与预期值相符。融合蛋白主要以包涵体形式高效表达,通过His Trap HP柱子使其得到进一步纯化。Western blot分析表明,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合。说明通过优化表达条件,获得拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达表达产物。

卵形鲳鲹主要致病链球菌多重PCR诊断技术的建立

【目的】快速、准确地检测卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和格式乳球菌(Lactococcus garvieae)4种主要的致病菌,为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据。【方法】针对4种致病菌的特异基因设计特异性引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R,建立多重PCR反应体系,通过调试各引物对之间的最佳比例以及最适退火温度,对反应体系进行优化及灵敏度测试。2014年6~8月,应用该体系对北海及湛江各养殖场的发病卵形鲳鲹进行检测,然后用通用引物扩增16SrRNA基因,经测序、比对检测体系的准确性。【结果】反应体系中cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最适浓度分别为0.2μmol/L,0.08μmol/L,1.6μmol/L和0.4μmol/L;最优退火温度为54.3℃;4种目标菌的检测灵敏度为5×10^(-2) ng/μL;11份病原样品检测中,2份出现海豚链球菌的目的条带,4份出现无乳链球菌的目的条带,5份未见目的条带,和测序分析结果一致。【结论】多重PCR方法能代替传统的微生物检测方法特异、快速、灵敏地检测4种致病菌。

光裸星虫ISSR-PCR反应体系的单因素优化试验

以光裸星虫为试验材料,通过单因素方法对影响其ISSR-PCR扩增效果的因子(模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、甲酰胺和二甲基亚砜)浓度进行研究。确立适合光裸星虫ISSR-PCR的反应体系:25μL体积含1×PCR buff-er、模板DNA用量为10-50 ng、TaqDNA聚合酶为0.75-1.75 U、Mg2+浓度为1.5-2.5 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.8-1.2μmol/L,甲酰胺和二甲基亚砜的添加并不能优化光裸星虫ISSR-PCR反应结果。利用所建立的体系对广西北海群体的20个光裸星虫个体基因组DNA进行ISSR-PCR扫描,结果表明,优化后的体系均能扩增出清晰、多态性高的条带。

复方茵陈合剂总黄酮测定方法研究

目的建立紫外-可见分光光度法测定复方茵陈合剂中总黄酮含量。方法以芦丁作为对照,依次用直接测定法、氯化铝-醋酸钠显色法、硝酸铝显色法,探究最优测定方法。结果本品最优显色法为硝酸铝显色法,测定波长为508 nm,在0.012 5~0.062 6 g/L范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=12.127 30 X+0.000 14(r=0.999 9),加样回收率平均值为99.49%(n=9,RSD为0.84%)。结论硝酸铝显色法可作为复方茵陈合剂中总黄酮的含量测定方法,该法简便、快速、稳定可靠。

星点设计-效应面法优化复方茵陈合剂的醇沉工艺

目的采用星点设计-效应面法优化复方茵陈合剂的醇沉工艺。方法以栀子苷含量和固形物去除率的总评归一值为指标,通过单因素实验考察药液相对密度、醇沉浓度、醇沉时间和搅拌速度对醇沉工艺的影响,结合医院制剂生产特点,通过趋势分析确定影响醇沉工艺的关键因素,最后采用星点设计-效应面法对关键因素进行进一步的研究与探讨。结果当药液相对密度为1.07,醇沉浓度为84%、醇沉时间为8h,搅拌速度为1762r/min时醇沉工艺达到最优。结论采用星点设计-效应面法优化了复方茵陈合剂的醇沉工艺,有助于进一步提升复方茵陈合剂工艺的稳定性。