姜黄素调控乳腺癌细胞增殖与转移机制研究

目的研究姜黄素对人乳腺癌细胞MDA-MB-453中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响及其对肿瘤细胞增殖和转移的作用。方法采用噻唑蓝(MTT)法和细胞计数观察姜黄素抑制MDA-MB-453细胞增生作用;采用transwell侵袭小室测定姜黄素对MDA-MB-453转移的影响;采用Real-time PCR和Western blot印迹法检测常氧和乏氧状态下姜黄素对MDA-MB-453细胞系中HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平的影响,同时采用Real-time PCR和ELISA法检测姜黄素对HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)mRNA水平和蛋白表达水平的影响。结果姜黄素对MDA-MB-453细胞体外生长和转移具有抑制作用;常氧、乏氧状态下加入姜黄素后,MDA-MB-453细胞系中HIF-1α的mRNA水平无变化,但蛋白水平明显降低,VEGF mRNA水平和蛋白水平均明显降低。结论姜黄素通过HIF-1α调控MDA-MB-453细胞系增殖和转移。

Hint2促进乳腺癌细胞株MCF7对紫杉醇注射液的敏感性

目的探讨高表达三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2)增强人乳腺癌细胞株MCF7对紫杉醇注射液敏感性的影响。方法构建高表达Hint2的载体pCMV-HA-Hint2并转染MCF7细胞,通过免疫荧光和Western blot方法检测Hint2的表达,采用噻唑蓝(MTT)法检测高表达Hint2后MCF7细胞对紫杉醇注射液的敏感性,采用流式细胞AnnexinV方法检测细胞凋亡。结果 pCMV-HA-Hint2转染36 h后,细胞的Hint2基因表达明显增加,5μmol.L-1的紫杉醇注射液处理24 h后,Hint2高表达组细胞活性为33.78%,而对照组细胞活性为44.12%。结论 Hint2高表达能显著增加MCF7细胞对紫杉醇注射液的敏感性。

Six1蛋白对在结肠癌细胞株HT-29增殖能力影响的实验研究

目的研究高表达Six1对人结肠癌细胞株HT-29增殖能力的影响。方法运用慢病毒构建高表达Six1的HT-29稳定细胞株,应用Western blot方法、MTT比色法、BrdU法检测Six1的蛋白表达。结果成功构建Six1表达的HT-29Six1+细胞,实验组HT-29Six1+细胞Six1蛋白表达量为对照组HT-29con的4.3倍;采用MTT法,以第1天的吸光度A值作为参照标准,HT-29Six1+组高于HT-29con组(第2天为2.35±0.68 vs 1.03±0.67,第3天为6.33±0.60 vs 2.44±1.01,第4天为14.70±1.40 vs 4.60±1.30,第5天为20.60±2.40 vs 9.25±1.60),从第3天开始,差异有统计学意义(P<0.05)。采用BrdU法HT-29Six1+组的比例高于HT-29con组[(45.97±1.21)%vs(29.56±1.05)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HT-29Six1+细胞株稳定高表达Six1,高表达Six1可以增强HT-29细胞的增殖能力。

IL-1β、IL-10在大鼠溃疡性结肠炎模型中的表达

目的探讨促炎因子IL-1β和抑炎细胞因子IL-10在三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇诱导的溃疡性结肠炎(ul-cerative colitis,UC)大鼠模型结肠组织中的表达,探讨其在该模型中的作用和意义。方法将64只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为正常对照组与UC模型组,每组32只。正常对照组不造模,UC模型组用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠诱导UC模型。观察2组实验大鼠第1、3、7、14天体质量变化、组织病理学改变及结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性。实时荧光定量PCR检测2组大鼠结肠组织细胞因子IL-1β、IL-10 mRNA的表达。结果与正常对照组相比,UC模型组第1、3、7、14天大鼠结肠组织学评分均明显升高(P<0.01),结肠组织MPO活性明显增高(P<0.01),IL-1β,IL-10 mRNA相对于GAPDH的表达量均明显增高(P<0.01)。结论促炎细胞因子IL-1β与抑炎细胞因子IL-10的失衡在TNBS诱导的UC模型大鼠发病中起重要作用。

Six1通过PI3K通路抑制肺癌细胞A549的增殖和迁移

目的研究Six1基因对人肺癌细胞A549增殖和迁移能力的影响及其作用机制。方法将Six1的特异小干扰RNA序列转染入A549细胞中,应用Western印迹法检测Six1在A549细胞中的蛋白水平的表达情况,应用MTT法和细胞计数观察低表达Six1对A549细胞增殖的作用,应用划痕实验和transwell侵袭小室实验检测A549细胞迁移能力的变化情况,应用Western印迹法检测PI3K信号通路蛋白的表达变化。结果在A549细胞中,特异的小干扰RNA使Six1在蛋白水平表达降低,低表达Six1的A549细胞系增殖和迁移能力下降,p-AKT的蛋白表达降低。结论在A549细胞系中Six1通过PI3K通路抑制A549细胞的侵袭和转移能力。

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2启动子报告基因质粒的构建和活性鉴定

目的三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2,histidine triad nucleotide binding protein 2)在肝癌组织中低表达并与临床病理分期和病人预后密切相关,为研究Hint2的基因表达调控,构建人Hint2启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定活性。方法提取人基因组DNA,以其为模板,将含有Hint2启动子的不同长度的片段插入荧光素酶质粒p GL3-basic,后与β-半乳糖苷酶共转染He La细胞,转染后24h通过β-半乳糖苷酶实验检测转染效率,通过荧光素酶实验检测转录活性。结果质粒p GL3-h1(-6--463,457bp),p GL3-h2(-6--1255,1249bp)构建成功后,与β-半乳糖苷酶共转染人子宫颈癌He La细胞。转录活性=荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值,结果显示p GL3-basic荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值为147.3272,而p GL3-h1为67936,p GL3-h2为64234.19。空质粒与p GL3-h1,p GL3-h2之间差异具有统计学意义,而p GL3-h1,p GL3-h2之间差异不具有统计学意义。结论 Hint2位于转录起始位点上游-6至--463之间的启动子区域具有强转录活性。

磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基p55PIK表达载体的构建及单克隆株的筛选

目的构建表达载体pEGFP-N1-p55PIK,在人胚胎肾细胞株HEK293中筛选其稳定表达的细胞株。方法 PCR扩增p55PIK基因全长,经过Xho1和Xma1酶切、T4DNA连接酶连接、DH5α转化,酶切和测序鉴定以确定构建质粒正确。转染人胚胎肾细胞株HEK293,G418筛选稳定表达p55PIK的单克隆细胞株,应用Western blot方法检测p55PIK蛋白的表达。结果 pEGFP-N1-p55PIK质粒经PCR、酶切、测序鉴定正确,经过G418筛选后获得稳定细胞株,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达,Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-p55PIK的细胞中p55PIK表达水平增高。结论正确构建表达载体pEGFP-N1-p55PIK,并在HEK293细胞中成功筛选出稳定表达p55PIK的细胞株,为进一步探讨p55PIK的功能提供了良好的工具。

磷脂酰肌醇-3-激酶p55γ-N末端24个氨基酸对体外培养HaCaT细胞增殖的影响

目的观察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的调节亚单位p55γ-N末端24个氨基酸抑制人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞增殖的作用。方法构建含有PI3K-p55γ-N末端24个氨基酸的腺病毒载体AD-N24-GFP及对照病毒AD-GFP,感染HaCaT细胞,流式细胞仪检测细胞周期进程,应用BrdU/PI双掺入法检测其对细胞DNA合成的影响,CFDA-SE(细胞增殖示踪荧光探针)标记法检测细胞增殖情况。结果 AD-N24能有效阻滞HaCaT细胞周期进程于G0/G1期,S期和G2/M期细胞减少,AD-N24-GFP组各期细胞分布为:G0/G1期(84.18±1.73)%,S期(7.60±1.47)%,G2/M期(8.22±1.33)%,而AD-GFP组各期细胞分布为:G0/G1期(61.14±2.76)%,S期(24.54±1.29)%,G2/M期(14.32±1.61)%,空白对照组各期细胞分布为:G0/G1期(65.78±2.11)%,S期(22.22±1.92)%,G2/M期(12.00±1.19)%,AD-N24-GFP组与AD-GFP组及空白对照组间G0/G1期和S期细胞比例的差异有显著性意义(P<0.05);BrdU阳性细胞比例显示:AD-N24-GFP组R2为:(5.89±1.33)%,AD-GFP组R2为:(27.09±2.61)%,空白对照组R2为:(24.91±2.04)%,提示AD-N24能有效抑制HaCaT细胞的DNA合成;CFDA-SE检测显示AD-N24-GFP组增殖指数(PI)为:(33.60±2.52),AD-GFP组PI为:(52.47±4.41),空白对照组PI为:(55.29±7.61),提示AD-N24能有效抑制HaCaT细胞的增殖。结论在HaCaT细胞中过表达N24能有效阻滞HaCaT细胞周期进程,干预其细胞DNA合成,抑制其细胞增殖。

Dach1表达下调促进结肠癌细胞SW480侵袭和迁移的机制研究

目的研究Dach1表达下调对结肠癌细胞SW480侵袭迁移能力的影响及其可能机制。方法用脂质体将si-Dach1转染进SW480细胞株;Western blot检测细胞Dach1及EMT信号通路蛋白E-cadherin、β-catenin、Zeb1的表达水平,Real-time PCR检测Zeb1的mRNA表达水平,Transwell侵袭迁移实验以及划痕实验检测对照组SW480con及SW480si-Dach1组细胞侵袭数目和迁移距离。miR-200c mimics转染SW480si-Dach1细胞重复上述实验。结果 SW480si-Dach1组的miR-200c表达量为SW480con组的0.531倍,SW480si-Dach1组Zeb1的转录水平表达高于SW480con组[(2.21±0.35)vs.(1.01±0.02),P<0.01],SW480si-Dach1组Transwell小室实验48 h迁移的细胞数多于SW480con组[(102.33±1.53)vs.(44.67±2.52),P<0.01],SW480si-Dach1组穿透基质胶的细胞数多于SW480con组[(45.33±2.52)vs.(17.33±0.58),P<0.01],SW480si-Dach1组划痕实验24 h的平均距离大于SW480con组[(111.67±5.86)μm vs.(44.21±3.11)μm,P<0.01],上述实验在SW480con组与SW480si-Dach1+miR-200c组之间差异没有统计学意义。Western blot实验中SW480si-Dach1组较SW480con组Zeb1及β-catenin表达升高,E-cadherin表达下降,而这些蛋白表达变化可以被高miR-200c逆转。结论低表达Dach1能够通过抑制miR-200c从而上调Zeb1表达,进而激活EMT通路,最终正性调控SW480细胞的转移和迁移能力。

高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

目的 观察高表达人Salvadorl（hSav1）蛋白对人胚肾293（HEK293）细胞增殖的影响.方法 构建含有绿色荧光蛋白（GFP）的hSav1质粒GFP-N1-hSav1;将构建好的GFP-N1-hSav1质粒在脂质体Lipofectamine 2000的介导下转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察质粒转染效率;分别在转染后12、24、36、48 h通过噻唑蓝（MTT）比色法计算细胞增殖抑制率,抑制率=[（对照-空白）-（给药-空白）]/（对照-空白）×100%;转染后36 h加入5-溴-2＇-脱氧尿苷（BrdU）,通过其掺入比率来显示hSav1对细胞增殖的影响.结果 质粒GFP-N1-hSav1构建成功,转染效率为70%-80%左右,蛋白hSav1明显高表达;MTT结果显示转染质粒后12、24、36、48 h,高表达蛋白hSav1组的细胞增殖抑制率分别为2%、5%、15%、23%,而阴性对照分别为2%、3%、2%、2%;BrdU结果显示,在HEK293细胞中高表达蛋白hSav1后细胞增殖抑制率为（27.3±3.8）%,阴性对照组的细胞增殖抑制率为（12.9±5.3）%,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 在人胚肾HEK293中高表达蛋白hSav1可明显抑制细胞增殖能力.

腔内非离断式Roux-en-Y吻合术在腹腔镜全胃切除术消化道重建中的应用

目的探讨腔内非离断式(Uncut)Roux-en-Y(URY)吻合术应用于腹腔镜全胃切除术消化道重建的安全性、可行性及近期疗效。方法2015年11月至2018年1月间,福建省立医院肿瘤外科对67例胃癌患者行腹腔镜全胃切除术腔内URY吻合术重建消化道,男性41例,女性26例;年龄50~81(61.9±7.4)岁,体质指数(23.4±3.2)kg/m^2;其中胃贲门部癌19例,胃体癌33例,胃底癌15例;肿瘤大小(3.4±2.3)cm;BorrmannⅠ型22例,Ⅱ型15例,Ⅲ型21例,Ⅳ型9例;高、中分化腺癌29例,低分化腺癌23例,印戒细胞癌15例。行常规腹腔镜下胃癌D2根治术后,采用Echelon-flex腔镜关节头直线型切割闭合器在幽门环下方2cm闭合离断十二指肠,在食管胃结合部上方离断食管;腹腔镜直视下完成URY吻合消化道重建:(1)食管空肠侧侧吻合:食管闭合端左下缘开窗0.5cm,距离Treitz韧带约25cm处空肠上提至食管下端,在对系膜缘侧开窗0.5cm,直线切割闭合器两臂分别经食管、空肠开窗处置入,切割闭合完成侧侧吻合;关闭食管空肠共同开口,完成食管空肠吻合,形成食糜流出道。(2)空肠侧侧Braun吻合:分别距食管空肠吻合口约10cm处输入袢近端空肠和35~40cm输出袢远端空肠对系膜缘分别开窗0.5cm,行近远端空肠侧侧吻合;关闭共同开口形成胆胰十二指肠液流出道。(3)闭合食管空肠吻合口输入袢空肠:距食管空肠吻合口2~3cm输入袢空肠无刀片直线闭合器(ATS45NK)闭合,阻断胆胰十二指肠液反流。收集这组病例临床资料进行回顾性系列研究,观察手术及消化道功能恢复情况、围手术期并发症,术后营养状态;通过术后随访时的内镜及影像学检查,评估吻合口功能及肿瘤复发等相关指标。结果67例患者均成功完成手术。手术时间(259.4±38.5)min,消化道重建时间(38.2±13.2)min,术中出血量(73.4±38.4)ml;淋巴结清扫数(36.2±14.2)枚,上切缘距肿瘤上缘(3.3±1.2)cm,上切缘距齿状线(1.2±0.7)cm,上切缘阳性1例(1.5%),经再次切除为阴性。辅助切口平均长度(3.2±0.4)cm。术后肠道排气时间(52.8±26.4)h,进食流质时间(64.8±28.8)h,术后住院时间(8.4±2.5)d。术后并发症发生率10.4%(7/67),其中Clavien-Dindo分级Ⅲa级4例,分别为食管空肠吻合口漏2例、十二指肠残端漏1例和腹腔感染1例,均予保守治疗痊愈。67例均完成随访,术后12个月营养指数为53.4±4.2,食管空肠吻合口直径(3.9±0.6)cm,Roux-en-Y滞留综合征发生率3.0%(2/67),反流性食管炎发生率4.5%(3/67),无食管空肠吻合口输入袢闭合再通,无吻合口狭窄、梗阻、无吻合口肿瘤复发。结论腹腔镜全胃切除术腔内URY吻合术重建消化道安全可行,术后消化道功能恢复快,近期疗效好。

K-ras、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1基因在结直肠癌组织中突变特征及其临床意义

目的 探讨K-ras、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1 （BRAF）基因在结直肠癌中突变特征及其临床意义.方法 采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）法检测412例结直肠癌组织K-ras、BRAF基因常见密码子突变特征,分析K-ras、BRAF突变与结直肠癌临床病理特征的关系.结果 412例结直肠癌K-ras基因突变率为37.9％,直肠癌K-ras基因突变率为45.2％,高于结肠癌（28.8％,P ＜0.05）.K-ras基因突变中单个位点突变率为35.4％,2个位点的突变率为2.2％,3个位点突变率为0.2％.K-ras突变常见于12和13位密码子,12位密码子占32.0％,分别为G12D（15.0％）、G12V（9.5％）、G12C（3.9％）、G12S （2.9％）、G12A（2.4％）和G12R （0.7％）,13位密码子占6.1％,均为G13D.K-ras基因突变方式以G→A为主.Ⅰ＋Ⅱ期结直肠癌K-ras基因突变率（30.4％）低于Ⅲ＋Ⅳ期（45.2％,P＜0.05）,基因位点突变分析只发现G12V突变率在TNM分期Ⅰ＋Ⅱ期的突变率（5.9％）低于Ⅲ＋Ⅳ期（13.0％,P＜0.05）.K-ras基因突变与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤大体类型、组织学分型以及淋巴结转移等临床病理参数无关（P＞0.05）.结直肠癌中BRAFV600E基因突变率为2.4％,其中结肠癌中的BRAF基因的突变率（4.9％）高于直肠癌（0.4％,P＜0.05）.结论 在结直肠癌中,K-ras基因突变以单个位点突变为主,其中又以G12D最为常见,其中G12V突变可能与结直肠癌进展相关.直肠癌K-ras突变率高于结肠癌,而结肠癌BRAF突变率高于直肠癌.K-ras、BRAF基因突变在结肠癌和直肠癌中的作用机制可能不同.

完全腹腔镜残胃癌根治术26例临床分析

目的探讨完全腹腔镜近端残胃癌根治术的安全性、可行性及近期疗效。方法回顾性分析福建省立医院2016年1月至2019年6月收治因胃良性病变曾行远端胃大部切除、BillrothⅡ式吻合术后的残胃癌病人,行腹腔镜近端残胃癌根治术,腔内Roux-en-Y吻合术重建消化道的26例病人临床资料。结果26例病人中肿瘤位于残胃底贲门9例,位于残胃空肠吻合口17例。病人均顺利完成腹腔镜残胃切除D2淋巴结清扫术及腔内Rouxen-Y食管空肠吻合重建消化道。手术时间(152.3±21.3)min,重建消化道时间(38.6±12.5)min,术中出血量(55.1±21.8)mL。平均清扫淋巴结(28.1±7.4)枚。上切缘距食道贲门连接线中位距离2.5(2.1,4.6)cm,距肿瘤上界中位距离5.5(4.1,6.2)cm,上切缘均未见阳性。辅助切口平均长度(4.1±0.8)cm。术后肛门排气时间(29.5±11.2)h,流质进食时间(19.1±8.6)h,术后住院时间(7.8±1.9)d。术后并发症:Clavien-Dindo分级Ⅰ级发生率为3.8%(1/26),辅助切口感染1例。Ⅱ级发生率为7.7%(2/26),其中炎性肠梗阻1例,腹腔感染1例,予保守治疗痊愈。无Ⅲ级以上并发症,无吻合口漏、出血、梗阻及手术相关死亡。26例病人均存活获得随访,平均随访时间9.2个月。食管空肠吻合口大小(4.6±0.5)cm,Roux-en-Y滞留综合征发生率为7.7%(2/26),反流性食管炎11.5%(3/26),无吻合口狭窄、未见肿瘤复发或转移者。结论应用完全腹腔镜技术行近端残胃癌术根治因胃良性病变行远端胃大部切除术后(BillrothⅡ式吻合)的病人安全可行,具有术中出血量少,术后恢复时间短等优点,并有满意的近期效果。

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2对结肠癌细胞SW620侵袭迁移的影响

目的 观察上调三联组氨酸核苷酸结合蛋白2（Hint2）表达对结肠癌细胞SW620侵袭迁移能力的影响,探讨Hint2表达调控SW620侵袭迁移的可能机制.方法 用慢病毒pLVX-IRES-ZsGreen1-Hint2载体转染293T后构建Hint2过表达SW620^Hint2＋细胞株;Western blot检测细胞Hint2的表达水平,Transwell侵袭迁移实验以及划痕实验检测结肠癌细胞侵袭数目和迁移距离,分析其与Hint2表达的关系.结果 成功构建Hint2过表达的SW620^Hint2＋细胞;SW620^Hint2＋组细胞Hint2蛋白表达量为SW620组的3.1倍;SW620^Hint2＋组穿透基质胶的细胞数显著少于SW620组[（52.33±5.05）％比（112.83±10.11）％,P＜0.05].SW620^Hint2＋组迁移的细胞数显著少于SW620组[（51.17±11.64）％比（111.17 ±11.64）％,P＜0.05].划痕实验24 h后SW620^Hint2＋组细胞迁移的平均距离显著短于SW620组[（0.37 ±0.03） mm比（0.71±0.04）mm,P＜0.05].细胞Hint2的表达水平与其侵袭及迁移能力呈负相关（r=-1.000,P＜0.01）.结论 成功构建后的SW620^Hint2＋细胞株稳定过表达Hint2,其侵袭及迁移的能力明显下降,由此提示Hint2的上调可能参与结肠癌细胞转移和迁移能力的负性调控。

右半结肠D3淋巴结清扫术对腹腔镜右半结肠癌根治术患者疗效分析

目的观察右半结肠D3淋巴结清扫术对腹腔镜右半结肠癌根治术患者疗效。方法选取2019年10月至2021年1月收治的199例右半结肠瘤患者进行研究,采用随机数表法将患者分为D3组(n=100例)和D2组(n=99例),两组患者均接受腹腔镜右半结肠癌根治术,D3组行D3淋巴结清扫术,D2组行D2淋巴结清扫术。应用SPSS22.0统计学软件进行数据分析,围手术期各项指标等计量资料以(x±s)表示,采用独立样本t检验;术后并发症等计数资料采用 χ^(2)检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。结果D3组患者淋巴结清扫数多于D2组(P<0.05),D3组患者手术时间、引流时间和住院时间均长于D2组,差异均有统计学意义(P<0.05);D3组和D2组患者并发症发生率分别为3.0%和10.1%,D3组低于D2组(P<0.05)。结论D3淋巴结清扫术可明显提升腹腔镜右半结肠癌根治术疗效,建议推广应用。