cfDNA浓度及完整性在癌症中的诊断及预后价值

癌症在世界范围内是一个重大的公共健康问题,有效的早期干预以及疗效监视可以降低肿瘤患者的发生以及死亡风险。在多数癌症中,外周血循环游离DNA(Circulating cell⁃free DNA,cfDNA)浓度及其完整性可能是一类有效的早期诊断、进展期患者识别以及预后监测指标。本文旨在综述cfDNA浓度及其完整性在不同癌症中的诊疗效能,并与当前临床上常用的肿瘤标志物进行对比,探讨该指标在临床实践中的应用价值以及前景。

阿尔茨海默病患者皮质额叶基因表达谱研究

目的:通过研究阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)患者皮质额叶中发生差异表达的基因,揭示AD发生、发展的分子基础。方法:利用基因芯片分析3例AD患者皮质额叶中基因表达谱,通过与4例正常对照间的比对,寻找存在表达差异的基因。结果:所检测的5000个基因中,共有49个基因存在着差异表达。在患者中13个基因表达水平升高,36个基因表达水平降低。上述基因与多种生理过程,如氧化应激、胆固醇平衡、钙信号转导、炎症反应等密切相关。结论:AD的发生、发展涉及多种基因表达水平和多个生理过程的改变。

利用荧光定量聚合酶链反应检测小鼠纹状体中Per1基因的表达规律

目的建立定量检测Per1 mRNA表达水平的系统,并检测小鼠纹状体中该基因的表达规律。方法提取小鼠纹状体总RNA,用Per1基因特异性引物进行聚合酶链反应(PCR),以荧光染料SYBR green I法进行实时检测。结果确定了Per1基因荧光定量的扩增和检测参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且扩增效率在90%以上。利用此检测体系发现小鼠纹状体内Per1基因的表达呈节律性波动。结论所建立的方法能够定量测定Per1 mRNA表达水平,具有灵敏度高,线性范围广的特点。纹状体中Per1基因表达的节律性波动提示黑质纹状体系统间的相互调节可能具有昼夜节律性差异。

MPTP作用下小鼠黑质和纹状体中不同时期基因表达变化

目的了解帕金森病小鼠模型黑质和纹状体中差异表达的基因以及在MPTP作用后不同时间点基因表达变化的规律。方法取16只SPF级C57BL/6J小鼠,用数字表法随机分为2组。MPTP组:30mg/kgMPTP腹腔注射1次。对照组:注射等量生理盐水。制模后分别在1d和2个月时分离黑质和纹状体。抽提总RNA,利用寡核苷酸芯片分析1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)作用下不同时间点的差异表达基因。结果所检测的1200个基因中,黑质在制模后第1天有13个基因差异表达,2个月时有6个基因差异表达;纹状体中第1天有12个基因差异表达,2个月时有13个基因差异表达。差异表达的基因与多种生理过程,如应激反应、蛋白质磷酸化、蛋白酶体系统、信号转导等密切相关。结论帕金森病的发生、发展过程涉及到多种基因表达水平和多个生理过程的改变。黑质中γ-氨基丁酸通路以及纹状体中蛋白质的磷酸化水平和正确折叠在MPTP小鼠模型中发生了显著变化。

临床医学科学学位型研究生培养的思考

现阶段,我国临床医学研究生培养主要分为2种形式：科学型学位和专业型学位。其中,科学型学位主要为高等医科院校和科研机构培养高素质的师资和科研人才[1]。如何针对上述目标,将研究生培养成为富有探索热情、具备坚实医学基础理论知识和相关技能、初步掌握科学研究思路和方法的合格人才至关重要。

帕金森病小鼠模型中分子时钟的变化

帕金森病人和帕金森病动物模型中都存在极为显着的节律丧失现象，包括体温变化节律性的丧失，心跳节律性的丧失，排尿节律性的丧失等。虽然在这些节律性丧失已经在生理水平和行为学水平得到反复的证实，但其分子机制仍然没有得到认识。近年来，一系列的节律基因逐步得到发现，包括Per1，Per2，Per3，Bmal1，Clock，Cry1，Cry2等。这些基因在转录和翻译水平相互调节构成网络，从而在分子，细胞，组织和整体水平产生节律。本研究使用MPTP处理C57小鼠，而制备出帕金森病小鼠模型。制模成功5天后，连续24小时，每隔4小时，处死小鼠。取小鼠大脑，纹状体，心脏，肝脏。

改进竞争性RT-PCR法在定量PER1基因表达中的应用

目的研究使用不同样品稀释液及变性高效液相色谱(DHPLC)梯度条件对定量检测PER1基因表达的影响。方法竞争性RT-PCR与DHPLC结合定量检测基因表达。结果样品稀释液中含有载体可极大提高实验的重复性、准确性;不同DHPLC梯度条件对定量结果无明显影响。结论建立定量PER1基因mRNA表达水平的竞争性RT-PCR系统有助于精确检测微量标本中节律基因表达的变化,探寻生物节律与疾病状态间的关系。

舰船目标三维转动SAR成像仿真研究

机载合成孔径雷达(SAR)对海面舰船目标侧视成像时,雷达与目标间的相对运动既包含载机与舰船的平移运动,也包含舰船在复杂海况下的横滚、俯仰和偏航等三维转动,运动形式会造成图像模糊。为了解决三维转动引起的成像散焦不清晰问题和提高系统的稳定性,在短时远距的典型条件假设下建立了舰船目标成像的距离-多普勒模型,并重点分析舰船横滚、俯仰和偏航的三维转动对所成图像的影响。采用时频分析方法成像,并进行仿真。仿真结果验证了成像模型的正确性及时频分析成像方法的优越性,提高了系统的性能。

C57小鼠肝、肾、脾、胸腺组织时钟基因的表达特点

目的探测不同脏器组织中时钟基因的表达水平及其波动性。方法用实时荧光定量PCR方法检测C57小鼠肝、肾、脾和胸腺中4种重要时钟基因mBMAL1、mPER1、mCRY1和mCRY2的表达。结果肝和肾中4种时钟基因的表达水平均有显著波动(P<0.01);而脾中仅mBMAL1、mPER1、mCRY1的节律性表达明显(P<0.01,P<0.001,P<0.05),并且波动振幅较为平和;胸腺中4种时钟基因的表达均不具备昼夜波动的特征,同时表达水平也与其他3种组织存在显著差异(P<0.01)。时钟基因所构成的环路在不同组织中也不尽相同,mPER1的负反馈效应在肝中较为主要,mCRY1和mCRY2的负反馈效应在肾和脾中较为主要。结论不同周围组织的分子时钟存在着显著的差异,其相关正负反馈元件和环路有待进一步研究阐明。

小鼠纹状体中神经递质相关基因表达的节律性波动

目的探讨纹状体神经肽强啡肽(dynorphin,DYN)、脑啡肽1(enkephalin1,ENK1)、P物质(substance P,SP)、胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)和多巴胺受体1和2(dopamine receptor1and2,D1r和D2r)是否受分子时钟机制的调控,它们的节律变化是否与时钟基因有关。方法分别对刚出生(产后3d)、断奶前(产后14d)和成年(产后60d)小鼠纹状体中上述基因24小时的mRNA用实时定量RT-PCR的检测方法观察其节律变化。结果产后3d小鼠纹状体内没有观察到相关基因的节律性变化;产后14d时,纹状体内D2r、DYN和ENK1基因随时间呈现节律变化,出生后60d时,纹状体内除D1r外,所有基因表达均随时间昼夜波动。结论小鼠纹状体中神经递质相关基因的昼夜表达变化规律是在出生后逐渐形成的。

基因芯片检测灵芝提取物对白细胞中免疫相关基因表达的影响

目的:灵芝对于免疫系统的调节还缺乏严格的临床证据,其关键是缺乏客观、系统评价灵芝对免疫系统调节效果的手段。基于此,采用基因芯片分析检测了灵芝对免疫相关基因表达水平的影响,从而揭示与灵芝功能密切相关的基因和途径。方法:实验于2002-12/2003-05在首都医科大学宣武医院神经分子生物实验室完成。①实验干预:血液材料来源于身体健康的宣武医院医护人员和学生12人,均对检测项目知情同意。平均年龄(31±4)岁,男女各6人。将其分为年龄、性别大致匹配的2组:安慰剂组和灵芝组,每组6人。灵芝组和安慰剂组对象分别服用灵芝胶囊和淀粉胶囊安慰剂,每人每天服用2次,每次2粒(相当于药用灵芝400mg),连续30d。灵芝胶囊主要成分为软壁灵芝孢子粉、灵芝提取物。②实验评估:服药前1天和服药30d后采用自动分析仪计算全血不同种类白细胞计数和不同种类白细胞所占比例。分离白细胞抽提总RNA,利用博星公司的cDNA芯片Biostar-H-IC-I检测了服用灵芝胶囊后白细胞中441个免疫相关基因的表达变化。结果:①所检测的441个免疫相关基因中,共有11个基因存在着差异表达。其中10个基因表达水平升高,1个基因表达水平降低。发生差异表达的11个基因中有2个参与信号转导过程,包括STAT4和LYN。服用灵芝胶囊后两个基因的表达量都显著增加。在发生差异表达的11个基因中有7个基因属于淋巴细胞表面抗原。②服用灵芝胶囊和安慰剂后白细胞总数和不同种类白细胞的百分比均未发生明显变化(P>0.05)。结论:①灵芝对免疫系统的调节功能主要通过调节淋巴细胞的活性而实现,而不是通过改变白细胞数量和分类计数。②STAT4和LYN参与的信号转导途径很有可能是灵芝胶囊作用的主要靶点。

参乌胶囊及其有效成分二苯乙烯苷对老年大鼠海马区神经生长因子及其受体表达的影响

目的观察本室自行研制的中药新复方参乌胶囊(SW)及其有效成分何首乌四羟基二苯乙烯苷(TSG)对老年大鼠海马区神经生长因子(NGF)及其受体表达的影响。方法老年SD大鼠从21月龄始,分别灌胃给予SW低、高剂量(0.8 g/kg、1.6 g/kg)和TSG低、高剂量(0.03 g/kg、0.06 g/kg)至24月龄。以6月龄大鼠为青年对照,未给药的24月龄大鼠为老年对照。应用实时定量PCR方法检测大鼠海马区NGF及其受体TrkA的mRNA表达水平,免疫组织化学染色和Western blot方法检测海马区NGF及TrkA表达水平。结果从基因和蛋白质水平观察到,老年大鼠海马区NGF及其受体TrkA的mRNA表达和蛋白表达明显降低。老年大鼠灌胃给予SW能够上调其海马区NGF mRNA和TrkA mRNA水平;SW和TSG对NGF蛋白表达有明显的增高作用,高剂量SW和TSG对TrkA表达的上调作用显著。结论 SW和TSG能够增高老年大鼠海马区NGF及其受体水平,提示它们可作用在神经元信号转导通路的起始端,有利于提高神经元的存活和功能。

α-突触核蛋白对MES23.5多巴胺能神经细胞的促增殖作用

目的:分析外源性野生型α-突触核蛋白对多巴胺能神经细胞增殖的影响及其分子机制。方法:实验于2005-04/11在北京老年病研究所神经生物室完成。向MES23.5多巴胺能神经细胞的培养基中加入重组人野生型α-突触核蛋白,孵育48h后用细胞免疫荧光标记法和Westernblot分析法检测α-突触核蛋白在细胞内的分布,用MTS法绘制生长曲线观察细胞增殖率,用基因芯片分技术观察α-突触核蛋白处理细胞的基因表达谱变化。结果:重组人野生型α-突触核蛋白可以进入MES23.5多巴胺能神经细胞,并促进其增殖。在α-突触核蛋白处理的细胞,有22个基因的表达发生明显变化,有3个基因与内吞相关,5个与转录有关,3个与蛋白质合成有关,3个与细胞生长和增殖有关,4个与分化有关,1个与增殖及分化均有关,2个与小泡生成和神经递质释放有关,1个与生理周期有关。结论:外源性α-突触核蛋白可能通过内吞作用进入MES23.5多巴胺能神经细胞,从而促进其增殖;α-突触核蛋白的促细胞增殖作用可能与其影响某些基因表达有关。

启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化与基因节律性表达的关系

目的探讨mPer2、mCry1和mDBP启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化是否影响E-box和BMAL1/CLOCK基因和蛋白相互作用的方式;以及启动子区的甲基化状态是否影响MAP激酶磷酸化酶1(MAP kinase phosphatise 1,MKP1)的组织特异性表达调控。方法分6个时间点取C57 BL/6J小鼠的肝脏和肾脏,提取DNA,通过重硫酸盐处理基因组DNA,以及测序检测E-box和周围CpG岛的甲基化状态。结果 mPer2、mCry1和mDBP启动子区E-box以及周围CpG岛无明显甲基化状态,肝脏和肾脏中MKP1的E-box以及周围CpG岛亦无明显甲基化状态。结论节律基因的启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化不参与节律基因表达的日节律性调控。

利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达

目的建立一组灵敏的检测时钟基因(c lock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况。方法培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系。利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况。结果确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子。利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整。结论巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整。时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用。

灵芝提取物对MPP^+诱导的Neuro-2a细胞自噬的影响

目的观察灵芝提取物(Ganoderma lucidum extract,GLE)对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP^+)诱导的Neuro-2a细胞自噬的调节作用。方法采用蛋白印迹检测自噬标志物LC3的转换(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)以及荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。同时Western blotting法检测AMPK/mTOR/ULK1、PINK1/Parkin、NIX/LC3蛋白的表达水平。结果激光共聚焦采集图像结果显示,MPP^+处理组细胞LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上,观察到呈点状聚集状态,而GLE干预组细胞点状聚集状态不明显。以LC3的点状聚集阳性细胞占总细胞的百分比评价自噬水平的高低。MPP^+组呈绿色点状分布的LC3阳性细胞百分比明显升高,GLE组明显降低。Western blotting法检测结果显示GLE组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低。同时,经GLE处理后,可以改善MPP^+损伤引起的AMPKα/mTOR/ULK1、PINK1/Parkin通路各蛋白异常表达。结论 GLE能抑制MPP^+诱导的Neuro-2a细胞的自噬反应,调节细胞自噬相关蛋白AMPK/mTOR/ULK1以及PINK1/Parkin的异常表达,表明GLE可能通过调节细胞自噬而发挥神经保护作用。

人类外周血hPer1基因节律性表达的研究

目的生物节律广泛存在于人类生活和工作中,为研究正常人节律基因表达特点,定量检测正常年轻人外周血中节律基因Per1(humanPeriod1,hPer1)的表达。方法实验对象为7名大学生(H1-H7),年龄24￣30岁,男性3名,女性4名。其中H7于实验前1天晚上值夜班。分别在09:00,15:00,21:00,03:00,09:00点抽取肘静脉血6mL,抽提全血总RNA。应用竞争性RT-PCR方法定量检测实验对象外周血中每人每个时间点hPer1基因的表达。结果人类外周血中hPer1基因的表达有显著节律性。表达高峰在09:00而低峰在21:00,两者之间的差异达2.29±0.9倍(P<0.01),第2天09:00hPer1基因表达水平又回到最高峰。结论hPer1基因的表达在外周血中存在节律性。

中国人群pitx3基因多态性与晚发散发性帕金森病的相关研究

目的分析pitx3基因多态性与晚发散发性帕金森病的遗传关联。方法使用连接酶检测反应(LDR)法,分析509例晚发散发性帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者和494例正常对照者中pitx3基因单核苷酸多态性(SNPs)位点rs2281983、rs4919621和rs3758549。随机选取10%样品直接测序进行验证。结果 pitx3基因SNP位点rs2281983、rs4919621和rs3758549的基因频率在晚发散发性帕金森病患者和正常对照组间差异无统计学意义。3个SNP位点与晚发散发性PD无关联。结论中国人群中,pitx3不是晚发散发性帕金森病的易感因素。

异柠檬酸脱氢酶1基因突变焦磷酸测序检测方法的建立

目的建立异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)基因突变的焦磷酸测序检测方法,确定该方法的检测灵敏度。分析焦磷酸测序法与直接测序法对于鉴定IDH1突变的差异。方法构建携带野生型和突变型IDH1基因的质粒,使用质粒优化焦磷酸测序方法。使用已知比例的野生型和突变型质粒作为模版,确定突变的检测灵敏度。针对96例胶质瘤患者手术切除标本的基因组DNA,分别使用直接测序法和焦磷酸测序法,鉴定IDH1基因突变类型,并比较。结果使用焦磷酸测序能够检测到低至2%的IDH1突变。直接测序检出突变阳性率为32.3%、焦磷酸测序检出突变阳性率为74.0%。结论焦磷酸测序法检测IDH1基因突变灵敏可靠,适合临床分子诊断。