数字PCR(digital PCR,dPCR)相比传统定量PCR具有多种优势,然而,其终点法的思路及单分子扩增体系需要对实验进行更细致的优化。数字PCR最低出版规范(the Minimum Information for the Publication of Digital PCR Experiments,d MIQE)提...数字PCR(digital PCR,dPCR)相比传统定量PCR具有多种优势,然而,其终点法的思路及单分子扩增体系需要对实验进行更细致的优化。数字PCR最低出版规范(the Minimum Information for the Publication of Digital PCR Experiments,d MIQE)提出了优化思路。然而,大多数发表的论文没有实现dMIQE的优化思路。本研究拟将利用探针的交叉扩增活性来实现数字PCR的优化。痕量DNA模板的检测以及定量是分子生物学中的重要应用之一。以结肠癌相关转录因子2(colon cancer correlation transcription factor 2,CCAT2)基因的G/T片段来模拟痕量核酸,并以梯度浓度的模板作为内参照来指示非特异扩增,进行微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。首先,以qPCR方法确认探针的交叉扩增活性,并通过梯度PCR方法确认最佳区分温度(59℃),用于随后的实验。在梯度模板对照指引下,针对非特异扩增做出设置。本研究通过应用具有交叉扩增活性的TaqMan~探针,以微滴式数字PCR技术,在不同通道以高低活性交叉确定痕量的PCR模板(T片段为6.8 copies/μL;G片段为4.2 copies/μL;总量为11 copies/μL),实现了交叉验证。本研究提出的以高低活性的扩增实现互相验证的策略,可以作为dMIQE的优化方案,并提高ddPCR的可信度。展开更多
文摘数字PCR(digital PCR,dPCR)相比传统定量PCR具有多种优势,然而,其终点法的思路及单分子扩增体系需要对实验进行更细致的优化。数字PCR最低出版规范(the Minimum Information for the Publication of Digital PCR Experiments,d MIQE)提出了优化思路。然而,大多数发表的论文没有实现dMIQE的优化思路。本研究拟将利用探针的交叉扩增活性来实现数字PCR的优化。痕量DNA模板的检测以及定量是分子生物学中的重要应用之一。以结肠癌相关转录因子2(colon cancer correlation transcription factor 2,CCAT2)基因的G/T片段来模拟痕量核酸,并以梯度浓度的模板作为内参照来指示非特异扩增,进行微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。首先,以qPCR方法确认探针的交叉扩增活性,并通过梯度PCR方法确认最佳区分温度(59℃),用于随后的实验。在梯度模板对照指引下,针对非特异扩增做出设置。本研究通过应用具有交叉扩增活性的TaqMan~探针,以微滴式数字PCR技术,在不同通道以高低活性交叉确定痕量的PCR模板(T片段为6.8 copies/μL;G片段为4.2 copies/μL;总量为11 copies/μL),实现了交叉验证。本研究提出的以高低活性的扩增实现互相验证的策略,可以作为dMIQE的优化方案,并提高ddPCR的可信度。
