丹酚酸A调控miR-940与miR-576-5p促进退变终板软骨细胞修复的作用研究

目的:观察丹酚酸A(salvianolic acid A,SAA)对退变终板软骨细胞(cartilaginous endplates cells,CEPCs)的干预作用,及其调控的潜在非编码RNA(micro-RNA,miRNA)作用靶点。方法:从腰椎间盘手术标本中分离CEPCs,用不同浓度SAA(2、5、10μM处理24、48、72 h,利用CCK-8检测细胞活性确定SAA的最适剂量和干预时间。通过阿利新蓝染色和对血小板反应蛋白解整合素金属肽酶-5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-5,ADAMTS-5)、基质金属肽酶3(matrix metallopepridase 3,MMP-3)、Ⅱ型胶原a1(clollagen typeⅡa1,Col2a1)的蛋白表达检测,分析SAA对IL-1β诱导的退变CEPCs的干预作用。进一步结合生信分析,以及实时荧光定量PCR(quantitative real-time,qRT-PCR)与Western blot检测,并应用miRNA模拟物(miR-mimics)与抑制剂(miR-inhibitor),验证SAA对潜在靶miRNAs的调控作用。结果:10μM SAA处理48 h显著提高了CEPCs活性,增加了白细胞介素(interlenkin-1β,IL-1β)所抑制的糖胺聚糖积累与Col2a1表达,并降低了细胞基质中ADAMTS-5与MMP3表达(P<0.05)。通过生物信息分析筛选与差异基因表达检测,确定了SAA的潜在靶miRNAs为miR-940和miR-576-5p。进一步在SAA处理组中加入miR-940-mimic或miR-576-5p-mimic,与SAA处理组相比过表达miR-940或miR-576-5p后CEPCs基质中ADAMTS-5与MMP3表达显著升高,Col2a1表达显著降低。结论:SAA能够提高CEPCs活性,改善退变CEPCs的基质成分表达,而SAA的调控作用与抑制miR-940和miR-576-5p表达有关,两者可能是SAA调节CEPCs退变的作用靶点。

补肾活血方对内源性“筋伤”腰椎失稳兔模型的影响

目的探究补肾活血方对内源性“筋伤”腰椎失稳兔模型的影响。方法22只健康新西兰兔行韧带损伤型“筋伤”腰椎失稳动物模型手术,造模后随机分为补肾活血方组和模型组,每组11只,另取11只健康新西兰兔为假手术组。补肾活血方组予补肾活血方中药溶液(生药3.597 g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,每日给药1次),假手术组、模型组灌胃等体积的生理盐水,均灌胃8周。于造模前及造模后4、8周行X线透视,进行椎体水平位移、椎间高度指数(disc height index,DHI)测算;取新西兰兔完整腰椎椎间盘,行HE染色以及TUNEL染色,观察各组病理情况。结果与假手术组比较,模型组椎体水平位移增加(P<0.05)、DHI明显降低(P<0.05)、椎间盘组织细胞凋亡率升高(P<0.05)。与模型组比较,补肾活血方组第8周椎体水平位移减少(P<0.05)、DHI升高(P<0.05),椎间盘组织细胞凋亡率在第4、第8周均降低(P<0.05)。结论补肾活血方可能通过减小腰椎椎体水平位移,提高椎体的DHI,降低椎间盘组织细胞的凋亡率,对韧带损伤型“筋伤”腰椎失稳动物模型起治疗作用。

循环牵张力作用下髓核外泌体对终板软骨细胞的影响

背景:终板软骨细胞在髓核-终板复杂的微环境中受到多种因素的调节,异常应力所引发的微环境改变对终板软骨细胞的影响尚需深入探究。目的:观察循环牵张力条件下髓核细胞外泌体的分泌情况,以及应力刺激髓核外泌体对终板软骨细胞的影响。方法:体外分离培养人腰椎髓核细胞,应用FX-5000T系统对髓核细胞进行循环牵张力加载,采用磁珠法提取应力与非应力条件下的髓核细胞外泌体,流式细胞术检测外泌体纯度与浓度。以PKH67荧光染料标记外泌体,将应力与非应力条件下的髓核细胞外泌体分别与终板软骨细胞共孵育24 h,以单独培养的终板软骨细胞为对照,观察终板软骨细胞对外泌体的摄取情况、终板软骨细胞的凋亡和活性以及终板软骨细胞基质中相关基因的mRNA表达。结果与结论:①一定条件的循环牵张力刺激可促进髓核细胞外泌体分泌,且该条件下的外泌体颗粒浓度高于非应力条件;②倒置荧光显微镜下可见,应力与非应力条件下的髓核细胞外泌体均可被终板软骨细胞摄取;③CCK8与流式细胞术检测显示,应力组终板软骨细胞的活性低于对照组(P<0.05)、凋亡率高于对照组(P<0.05);④RT-PCR检测显示,与对照组比较,非应力组基质金属蛋白酶3、骨形态发生蛋白2 mRNA表达增加(P<0.05);与对照组比较,应力组Ⅱ型胶原mRNA表达降低(P<0.05),解聚蛋白样金属蛋白酶5、基质金属蛋白酶3及β-连环蛋白mRNA表达升高(P<0.05);与非应力相比,应力组Ⅱ型胶原mRNA表达降低(P<0.05),解聚蛋白样金属蛋白酶5、基质金属蛋白酶3及骨形态发生蛋白2 mRNA表达升高(P<0.05);⑤结果表明一定条件的应力可促进髓核细胞外泌体分泌,且该条件下的外泌体可抑制终板软骨细胞的活性,造成细胞基质合成与分解代谢紊乱。