甜菜碱阻断PI3K/AKT介导的EMT途径抑制食管癌细胞的迁移及侵袭

目的 探究甜菜碱(BET)对人食管癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT)的影响及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路的调控作用。方法 体外培养人食管癌OE19细胞系,分为对照组(不做干预)、200/300/400 mmol/LBET组、阳性药组(3 mg/L顺铂)、BET+抑制剂组(300 mmol/LBET+30μmol/L PI3K/AKT通路抑制剂LY294002)和BET+激活剂组(300 mmol/LBET+10μmol/L PI3K/AKT通路激活剂SC79),干预24 h。采用活细胞计数(CCK-8)法测定人食管癌OE19细胞活力;Transwell小室测定细胞的迁移和侵袭能力;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法对细胞EMT表达水平进行分析;蛋白免疫印迹(WB)法测定EMT及PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平。结果 与对照组比较,不同浓度BET组的细胞活力随浓度增加逐渐降低,其中300 mmol/L组和400 mmol/L组显著降低(P<0.05),为避免细胞死亡过多对实验的影响,故选择300 mmol/L组进行后续实验。后续实验中,与对照组相比,300 mmol/L组和阳性药组细胞迁移数、侵袭数及p-PI3K、p-AKT、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白水平下降(P<0.05),N-cadherin、Vimentin mRNA水平下降(P<0.05),E-钙粘蛋白(E-cadherin)mRNA和蛋白水平上升(P<0.05);与300 mmol/L组相比,BET+抑制剂组细胞迁移数、侵袭数及p-PI3K、p-AKT蛋白、N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白水平下降(P<0.05),E-cadherin mRNA和蛋白水平上升(P<0.05),BET+激活剂组细胞迁移数、侵袭数及p-PI3K、p-AKT蛋白、N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白水平上升(P<0.05),E-cadherin mRNA和蛋白水平下降(P<0.05)。结论 BET可抑制PI3K/AKT通路的活化从而抑制人食管癌OE19细胞的迁移、侵袭和EMT进程。

胃癌组织c-met蛋白表达的意义及其与微血管密度的关系

目的探讨cmet蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌临床病理特征及其肿瘤微血管密度的关系。方法对47例手术切除的胃癌组织采用免疫组织化学法检测cmet蛋白的表达及其肿瘤微血管密度。结果胃癌组织中cmet蛋白表达阳性率为85.1%,cmet阳性率与胃癌肿瘤的直径、有无淋巴结转移、浸润深度、TNM分期、是否有淋巴管及静脉癌栓有关;cmet阳性组胃癌微血管密度高于对照组。结论cmet蛋白的表达促进了胃癌的生长、浸润及转移,并促进胃癌的血管生成,与胃癌预后不良及临床病理特征有重要关系。

乙酰肝素酶在肿瘤发生、发展、转移及康复预后中的作用

细胞外基质(extrcellularmatrix,ECM)和基底膜(Basementmembrance,BM)是肿瘤细胞侵袭及转移的屏障。糖氨聚糖是此屏障的主要成分之一,它的主要成分为硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparinsulphateproteoglycan,HSPGs)。肝素酶是近年来发现并克隆成功的酶,与肿瘤侵袭和转移相关,是裂解连接于HSPGs核心分子上硫酸肝素的一类葡糖苷酸内切酶。肝素酶在转移性肿瘤组织中表达程度与患者的预后具有相关性,癌症患者检测肝素酶的表达将对手术范围的选择有参考价值,术后监测肝素酶的表达水平,有望成为判断患者的复发、预后、生活质量的一个新的指标。因此,对乙酰肝素酶的结构、功能、基因定位、分子生物学特征在正常组织和肿瘤组织中的表达及其作用机制等方面进行详细综述。对肝素酶抑制剂及其临床应用前景进行简要概括。

胃癌组织中肝素酶mRNA的表达意义

目的 :探讨肝素酶mRNA在胃癌及其癌旁组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系 .方法 :采用逆转录-聚合酶链反应 (RT PCR)法检测肝素酶mRNA在 4 7例手术切除的胃癌组织及癌旁组织中的表达 .结果 :胃癌组织中肝素酶表达阳性率明显高于相应的癌旁组织 (74 .5 %vs1 9.1 % ,P <0 .0 1 ) .肝素酶阳性表达率与胃癌患者的肿瘤直径、有无淋巴结转移、浸润深度以及TNM分期有关 ,而与胃癌患者的年龄、性别、分化程度及有无远处转移无关 .结论 :肝素酶的高水平表达促进了胃癌的生长、浸润及转移 。

人肝素酶基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建人肝素酶正义和反义腺病毒表达载体.方法:用EcoRI从pcDNA3-hpa质粒上切下约1.7kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRI酶切位点上,经BamHI酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正义重组质粒进一步采用测序鉴定其方向性.结果:经BamHI酶切后,正义质粒形成4.3+1.4kb两条带,而反义重组质粒为5.1+0.4kb两条带,与理论计算值完全一致;测序结果与GeneBank报告的肝素酶序列完全一致.结论:成功构建了人肝素酶的正、反义腺病毒表达载体,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.

F68及其联合DMSO对脐血造血细胞的低温保护作用

目的研究普鲁兰尼克(F68)及其联合DMSO在-80℃条件下对脐血造血干细胞的低温保护作用,为临床应用提供依据.方法脐血造血细胞冻存30、60、90 d后复苏,应用台盼蓝拒染率、集落形成试验、3H-TdR掺入率等,测定经F68保护体系冻存的脐血活力,并与目前通用的冷冻保护剂二甲亚砜及CP-1进行了对比研究.结果在-80℃条件下,F68对脐血造血细胞具有明显的冷冻保护作用,并与DMSO具有协同保护效果,联合F68及DMSO的保护体系可使MNC、CFU-GM的平均回收率及台盼蓝拒染率在第90天时分别达到(83.4±6.3)%,(68.8±7.9)%, (92.5±5.1)%,优于目前通用的细胞冻害保护液CP-1及DMSO.90 d的冻存期内,脐血细胞活力无明显下降.结论 F68及其与DMSO组成的冻存方案对脐血造血干细胞具有良好的冻存保护效果.

肝素酶表达鉴别良、恶性腹水无价值

目的:研究腹水脱落细胞及腹膜活检标本中肝素酶的表达,探讨肝素酶用于鉴别良、恶性腹水的可行性.方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测47例腹水脱落细胞中肝素酶mRNA的表达,同时利用免疫组织化学法检测肝素酶蛋白在36例腹膜活检标本中的表达,与相关的临床资料进行分析.结果:肝素酶mRNA在良、恶性腹水脱落细胞中的表达无明显差异(P>0.05).在腹膜活检标本中,肝素酶蛋白不仅存在于腹膜癌细胞中,在结核性腹膜炎上皮样细胞、郎格罕巨细胞、淋巴细胞中及异位的子宫内膜细胞及其间质细胞中均有表达;免疫组织化学法检测腹膜组织中,良、恶性腹水组之间的肝素酶阳性率亦无显著性差异(P>0.05).结论:肝素酶在良性腹水中的高表达可能与腹水脱落细胞中的炎性细胞增高有关.腹水脱落细胞中肝素酶mRNA的表达不能用于良恶性腹水的鉴别.

生长抑素联合埃索美拉唑对胆管结石ERCP术后胰腺炎及高胰淀粉酶血症的预防效果

目的分析ERCP术后应用生长抑素联合埃索美拉唑对胰腺炎及高胰淀粉酶血症的预防效果。方法选取78例我院2014年8月至2015年12月期间行胆管结石ERCP取石术患者作为研究对象,将其随机分为对照组(36例,行常规治疗)和治疗组(42例,在对照组基础上联合应用生长抑素、埃索美拉唑治疗),观察患者的胰腺炎和高胰淀粉酶血症的发生率。结果对照组胰腺炎的发生率为11.1%,高胰淀粉酶血症发生率为16.7%;治疗组胰腺炎的发生率为4.8%,高胰淀粉酶血症发生率为2.4%,两组患者胰腺炎、高胰淀粉酶血症的发生率比较具有统计学意义(P<0.05)。在血清淀粉酶恢复正常时间以及症状缓解时间方面,治疗组同对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。在手术后24小时血清CRP水平方面,同手术前比较,呈现出一定程度的升高,但是对照组升高程度更为显著(P<0.05)。结论胆管结石ERCP取石术后应用生长抑素联合埃索美拉唑治疗,可以降低胰腺炎、高胰淀粉酶血症的发生率,具有较高的应用价值。

米曲菌胰酶片治疗胆囊切除术后消化不良的疗效观察

目的分析米曲菌胰酶片治疗胆囊切除术后消化不良的疗效。方法 50例行胆囊切除术后发生消化不良患者使用双盲法分为对照组和观察组,每组25例。对照组使用埃索美拉唑镁肠溶片治疗,观察组在对照组的基础上加用米曲菌胰酶片,分析比较两组治疗效果及不良反应。结果对照组患者治疗总有效率为72.00%,观察组为96.00%,观察组治疗效果优于对照组,比较差异具有统计学意义(P<0.05)。两组不良反应率均为8.00%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论对于行胆囊切除术后消化不良疾病患者,使用米曲菌胰酶片加以治疗,临床效果显著,安全性强,值得进一步推广。

内镜下止血夹治疗高危消化性溃疡出血患者的临床效果

目的探讨内镜下止血夹治疗高危消化性溃疡出血患者的临床效果。方法选择医院2014年4月至2016年4月收治的高危消化性溃疡出血患者131例作为试验对象。根据高危消化性溃疡出血患者临床接受的不同治疗方法完成分组。两组首先选择相同的内科治疗方法;试验组(66例)采用内镜下止血夹进行治疗;对照组(65例)采用内镜下高频电凝或局部注射治疗的方法;对两组的及时止血率及48 h内出血复发率进行比较。结果在及时止血率方面,试验组(100.00%)与对照组(100.00%)比较,差异无统计学意义(P>0.05);在48 h内出血复发率方面,试验组(1.52%,1例)明显低于对照组(23.08%,15例),差异有统计学意义(P<0.05)。结论对于消化性溃疡出血患者,治疗方法选择内镜下止血夹的方法,可以获得显著效果,表现出操作便捷及安全性较高等优点。

内镜下黏膜剥离术治疗早期胃癌的疗效分析

目的分析内镜下黏膜剥离术治疗早期胃癌的临床疗效。方法60例早期胃癌患者,随机分为观察组及对照组,各30例。观察组采用内镜下黏膜剥离术进行治疗,对照组采用常规外科肿瘤切除术进行治疗。比较两组患者的肿瘤切除率、术后并发症发生情况、手术时间及住院时间、术后复发率及生存率。结果两组患者的肿瘤均达到完全切除,切除率均为100.00%。观察组患者的术后并发症发生率3.33%低于对照组的20.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者均未出现其他严重并发症。观察组患者的手术时间为(0.87±0.18)h,住院时间为(4.25±0.28)d,均短于对照组的(1.14±0.37)h、(6.69±0.97)d,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者术后2个月、6个月、1年、2年经胃镜及胸、腹部CT检查均无局部复发及远处转移情况发生。随防2年发现,观察组患者的生存率为96.67%(29/30),与对照组的93.33%(28/30)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论内镜下黏膜剥离术治疗早期胃癌的临床疗效显著,可有效减少术后并发症发生率,促进患者尽早恢复,值得临床推广应用。

树突状细胞扫描电镜样本制备方法

目的 探讨具有特殊结构的悬浮树突状细胞的扫描电镜制样方法。方法 对比观察细胞离心成团与自然沉降法制备扫描电镜样品对细胞形态学的影响。结果 自然沉降法能很好地显示树突状细胞的形态结构。结论 自然沉降法是制作具有特殊结构悬浮细胞的扫描电镜制样方法。

针对端粒酶蛋白催化亚单位的肿瘤免疫治疗研究

端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)相对分子质量Mr 127 000, 包含1 132个氨基酸,其基因位于5号染色体短臂的最末端(5p15.33),在90%以上的人类肿瘤中高表达,而正常成熟组织中则基本没有表达,可作为广谱的抗肿瘤治疗分子靶点.DC是已知体内激活静息T细胞功能最强的专职抗原递呈细胞,经DC递呈hTERT抗原表位信息后,CTL能识别从hTERT提取的多肽表位,并在体外杀伤多种组织来源的hTERT阳性的肿瘤细胞.因此hTERT是迄今发现的一个最具应用前景的肿瘤广谱相关抗原,针对hTERT的肿瘤免疫基因治疗有可能成为肿瘤免疫治疗的又一研究热点.

肝素酶:一种新的广谱的肿瘤转移相关抗原在中晚期肿瘤免疫治疗中的作用研究进展

肝素酶(Hpa)是裂解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的唯一酶类,能破坏细胞外基质及基底膜,参与肿瘤血管生成,与肿瘤的侵袭转移密切相关．目前的研究表明,Hpa在大多数中晚期肿瘤中都有表达,尤其在转移性肿瘤中强表达,而Hpa表达的下调可以抑制肿瘤细胞的转移,提示Hpa可以作为一种广谱的肿瘤转移相关抗原用于中晚期肿瘤的免疫治疗．Hpa疫苗的开发可望为中晚期肿瘤的治疗开辟新的途径．本文详细综述了Hpa的结构与功能、对肿瘤转移的促进作用及其机制、以及其作为肿瘤转移相关抗原用于中晚期肿瘤免疫治疗的可能性．

胃黏膜癌变过程中hTERT和相关基因表达的变化及其临床意义

目的探讨端粒酶逆转录酶(hTERT)、c-myc、bcl-2、NF-κB蛋白在正常胃黏膜(normalmucosa,NM)、肠化(intestinalmeta-plasia,IM)、异型增生(dysplasia,DYS)、早期胃癌(earlygastriccancer,EGC)和进展期胃癌(advancedgastriccancer,AGC)中的表达水平、相互联系及其临床意义。方法经手术或胃镜病理证实的不同病变胃黏膜组织132例为研究对象(其中NM20例、IM30例、DYS15例、EGC24例、AGC43例),采用免疫组化SP法分别检测其hTERT、c-myc、bcl-2、NF-κB的表达水平,并对各指标阳性表达率、相关性及临床病理联系进行比较分析。结果在胃黏膜癌变过程中,除bcl-2外,hTERT、c-myc、NF-κB的表达随着胃黏膜病变程度的加重而逐渐增加,各组间比较差异显著;进一步分析表明hTERT与c-myc在IM、DYS、AGC等3组中具有显著的相关性(P<0·05),而hTERT与bcl-2、NF-κB在IM、DYS、EGC、AGC等各组中均无显著的相关性(P>0·05);临床病理分析表明,hTERT在低分化及未分化中的表达显著高于高、中等程度分化(P<0·05),而与性别、年龄、肿瘤大小等无关。结论hTERT随着胃黏膜病变程度的加重,其阳性表达率逐渐增高,提示hTERT可能在胃黏膜癌变过程中具有重要意义,是胃黏膜癌变的早期事件;c-myc过表达可能是激活hTERT过表达的重要调节因素;hTERT不仅可以作为胃黏膜癌变的早期诊断指标,而且有可能成为胃癌或其他肿瘤基因治疗或免疫治疗的良好靶位。

负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的:构建负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的复制缺陷型腺病毒.方法:将克隆有正义hTERTcDNA的腺病毒穿梭质粒pDC315-hTERT与腺病毒包装质粒pBHGlox-DeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒表达载体(Ad-hTERT).对Ad-hTERT扩增、纯化并浓缩后,进一步行感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.结果:纯化浓缩后的Ad-hTERT滴度可达5×1012pfu/L.电镜下可见在HEK293细胞中形成的病毒颗粒,PCR双引物鉴定Ad-hTERT可扩增出Ad及hTERT特异片段,而对照则不能扩出hTERT片段.结论:成功构建了负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒.

负载肝素酶复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/ml。电镜证实病毒浓缩液中存在病毒颗粒,并可见病毒在HEK293细胞中复制。PCR双引物鉴定Adhpa可扩增出Ad及hpa特异片段,而对照则不能扩增出hpa片段。结论成功包装了负盘。

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染

目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6。方法采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认。用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果。结果经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性。转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光。结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础。

hTERT基因修饰对人外周血树突状细胞生物学行为的影响

目的观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因修饰对树突状细胞生物学行为的影响。方法用负载hTERT目的基因的复制缺陷型腺病毒(rAd-hTERT)感染原代培养的人树突状细胞(DC)以获取hTERT基因修饰的DC(DC-hTERT),采用免疫组化及Westernblot法检测DC-hTERT内hTERT及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;采用流式细胞术检测DC-hTERT表面成熟标志的变化;采用MTT法检测DC-hTERT的增殖能力。结果rAd-hTERT感染DC后hTERT蛋白表达明显增加;流式细胞术检测显示,感染Ad-hTERT后DC表面成熟指标CD83及CD86无明显变化;成熟DC经hTERT修饰后的生长曲线显示,DC-hTERT在前2周数量稍有增加,但DC/PBS及DC/rAd-LacZ数量明显下降,在第3周三者数量均有下降趋势,但DC-hTERT组细胞数量仍明显多于其他两组;Westernblot检测显示DC-hTERT内PCNA的表达明显增强。结论hTERT基因表达上调后,DC增殖能力明显增强,衰老速度延缓。

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体.方法:用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向.结果:经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0+6.4 kb两条带.反义重组质粒为1.0+2.5+3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性.结论:成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.