STAT3荧光素酶报告基因检测系统的构建及其检测STAT3活化能力的研究

目的构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统并检测STAT3活化能力,为筛选STAT3活性调控相关药物提供实验基础。方法基因合成STAT3反应元件序列,退火形成含酶切位点的双链DNA,内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切报告基因载体p GL6-TA,T4 DNA连接酶将STAT3反应元件插入p GL6-TA载体多克隆位点,将该载体转染He La细胞,G418筛选STAT3荧光素酶报告基因稳定表达的单克隆He La细胞株。5,10,20 ng/ml不同浓度激动剂IL-6和20,40,80μmol/L抑制剂S3I-201刺激单克隆He La-STAT3-Luc细胞,检测荧光素酶对应的发光值验证STAT3荧光素酶报告基因检测系统的检测能力。结果测序和比对结果显示,STAT3荧光素酶报告基因系统p GL6-STAT3-Luc中STAT3反应元件序列正确;G418成功筛选出稳定表达STAT3荧光素酶报告基因的单克隆He La细胞株;5,10和20 ng/ml浓度IL-6可刺激He La-STAT3-Luc细胞中荧光素酶的活性显著升高(P<0.001),且分别升高5.4,10.3和20.0倍;不同时间点检测1 ng/ml和5 ng/ml浓度IL-6刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性呈现线性增长趋势;40μmol/L和80μmol/L浓度的抑制剂S3I-201与10 ng/ml浓度IL-6共刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性显著降低(P<0.001),STAT3活化的抑制率分别为18.9%和43.7%。结论成功构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统,该系统具有有效检测STAT3活化水平的能力。

重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。

人细胞角蛋白1基因的克隆、原核表达及纯化

目的克隆人细胞角蛋白1(cytokeratin 1,CK1),原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,用特异性引物PCR扩增人CK1编码区全长基因(NM_006121.3),内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PCR产物和p ET-28a载体,T4 DNA连接酶将人CK1编码区全长基因克隆到pET-28a载体上,IPTG诱导融合蛋白his-CK1的表达。融合蛋白经Ni^(2+)亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定表明构建表达载体中人CK1序列正确;融合蛋白his-CK1的相对分子量为70 kD,并在大肠杆菌中高效表达;融合蛋白以包涵体形式,在变性条件下纯化融合蛋白his-CK1,其纯度大于90%;纯化的融合蛋白his-CK1可与商品化CK1抗体以及His抗体特异性结合。结论成功构建了原核表达质粒pET-28a-CK1,并成功诱导表达及纯化融合蛋白his-CK1。

老年髋部骨折患者个体化术后谵妄风险预测模型的构建及验证

目的构建并验证老年髋部骨折患者个体化术后谵妄风险预测模型。方法回顾性分析2016年12月至2021年1月393例西安市中心医院骨科行手术治疗的老年髋部骨折住院患者的临床数据,将2016年12月至2020年7月收集的333例患者的临床数据作为模型训练集,以术后发生谵妄为研究终点,基于模型训练集,利用单因素和多因素Logistic回归筛选出术后谵妄的独立相关因素。通过回归系数建立模型,结合R语言的rms包绘制列线图,并对模型进行区分度、校准度及临床适用性检验。利用Bootstrap在训练集中重复抽样1000次对模型进行内部验证,另收集2020年8月至2021年1月在西安市中心医院骨科行手术治疗的60例老年髋部骨折住院患者的临床数据作为验证集对模型进行外部验证。结果共纳入393例老年髋部骨折患者,训练集333例,验证集60例。单因素和多因素Logistic分析显示,痴呆、术前白蛋白水平、术中低血压为老年髋部骨折患者术后谵妄的独立相关因素。根据各相关因素及回归系数得出预测模型:P=1/(1+e^(-Z)),Z=1.396×是否痴呆-0.275×术前白蛋白水平+1.420×是否术中低血压+6.875。训练集中模型的截断值为0.235,特异度和灵敏度分别为0.875和0.622,验证集中模型的截断值为0.211,特异度和灵敏度均为0.800,训练集及验证集受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)下面积(area under curve,AUC)分别为0.827(95%CI:0.762~0.892)和0.836(95%CI:0.716~0.956),通过Bootstrap重复抽样1000次后模型内部验证的AUC为0.831。训练集及验证集校准曲线的斜率分别为1和1.066,Hosmer-Lemeshow拟合优度检验的P值分别为0.124和0.743,临床决策曲线显示在训练集及验证集中模型预测术后谵妄的最大净获益值阈值概率区间分别在5%~90%和3%~90%。结论构建的模型可对老年髋部骨折患者术后谵妄的风险进行预测。

Fas/FasL/Caspase-9凋亡基因多态性和环境危险因素的交互作用与腰椎间盘突出症的关系

目的探讨凋亡相关基因、环境危险因素及其交互作用在腰椎间盘突出症（LDH）中的病因学角色。方法采用病例-对照研究方法,选取128例住院的LDH患者和132例年龄和性别与之匹配的正常对照者,采集外周静脉血样并提取DNA。利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析法检测Fas-1377G/A rs2234767、Fas-670G/A rs1800682、Fas rs2147420、Fas rs2296603、Fas rs7901656、Fas rs1571019、FasL-844C/T rs763110、CASP-9-1263A〉G rs4645978,CASP-9-712C〉T rs4645981三个基因9个多态性位点基因型。采用非条件Logistic回归模型分析Fas、FasL和CASP-9基因的多态性与LDH患病风险的相关性。采用多因素Logistic回归模型评价腰椎负荷、睡床类型、业余运动、业余活动等环境危险因素与凋亡相关基因的交互致病效应。结果年龄、性别在病例组和对照组中的分布差异无统计学意义,均衡性较好;而腰椎负荷、体重指数、睡床类型、业余运动、业余活动在病例组和对照组中差异存在统计学意义（P〈0.05）。关联分析发现,FasL-844C/T（rs763110）、CASP-9-1263A〉G（rs4645978）的多态性和LDH存在显著关联,FasL-844C/T TT基因型、CASP-9-1263A〉G GG基因型可能是腰椎间盘突出症的高风险基因型。环境-基因交互作用分析发现,FasL-844TT基因型和腰椎负荷3-4级交互作用机制在LDH发生中为超相乘模型,CASP-9-rs4645978GG基因型和腰椎负荷3-4级交互作用机制在LDH发生中为次相乘模型。结论 FasL、CASP-9基因和腰椎负荷及其交互作用在LDH发病机制中发挥重要作用。提示LDH的患病风险可能由环境危险因素和遗传易感基因共同决定,不同基因型和同一环境因素或不同环境因素的交互作用机制不同。

Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物的构建及在滑膜肉瘤小鼠模型上的应用

目的建立Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物并利用复合物制作移植瘤动物模型,为其他软组织肿瘤动物模型的建立提供思路。方法培养扩增SW982细胞,消化收集细胞,用Metrigel对SW982细胞进行重悬,同时加入VEGF,应用Transwell制作Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物,并进行培养,HE染色观察细胞支架复合物形态结构。选取10只4周龄雌性SCID小鼠,随机分成支架组和对照组。支架组小鼠腋下移植细胞支架复合物,对照组注射移植细胞培养基悬液。8周后,比较两组造模成功率,取材HE染色观察肿瘤的组织形态特点。结果利用Metrigel对SW982细胞进行立体式培养,能够很好的模拟细胞在体的生长状态。采用细胞支架复合物构建滑膜肉瘤动物模型,成瘤率较对照组明显提高,且肿瘤体积更大,细胞密度更高,肿瘤内部有新生血管。结论利用MetrigelVEGF-SW982细胞支架复合物构建滑膜肉瘤动物模型,能够极大地提高模型成瘤率,为滑膜肉瘤的研究提供便利。

Colles骨折的中西医治疗进展

Colles 骨折多发于老年群体,对患者造成了极大的生活不便。传统临床治疗多以手法复位、小夹板固定以及中药等方式进行治疗,但是治疗周期较长,患者治疗依从性相对较低,现代医疗注重外固定支架、切开复位等治疗方式,中西医联合治疗Colles骨折取得了令人满意的治疗效果。本文以近年来Colles骨折的中西医治疗做一综述,进一步探讨其临床应用有效性。

10kV配网运维现状和管理模式探析

伴随着我国社会经济的不断发展,配电网络覆盖的面积越来越广,电力供应的压力也越来越大,同时,人们对电力的质量和水平也有了更高的要求.增氧才能够保障配电网安全、可靠、优质、经济运行是当期配电过程中需要解决的难题.本文在对当前我国10kv配网运维的主要现状介绍的基础上,对有效的运维管理模式进行了探讨.

腹腔镜手术与开腹手术治疗异位妊娠临床效果分析

目的:分析开腹手术与腹腔镜手术在治疗宫外孕过程中的临床效果,并对比分析各自的优缺点。方法:对两院2010年10月~2011年9月期间两院收诊的127例宫外孕患者的临床资料进行回顾性分析,其中66例患者进行了传统的开腹手术,其余61例患者进行了腹腔镜手术。对比分析两种治疗方法的手术时间、术中的出血量、肛门排气时间、停留尿管时间、术后腹痛症状消失时间及住院时间,并对所有患者进行随访。结果:进行腹腔镜手术患者的术中出血量均小于开腹手术,手术时间、肛门排气时间、停留尿管时间、术后腹痛症状消失时间及住院时间较开腹手术患者的相应时间要短,均有显著性差异(P【0.05)。结论:腹腔镜手术较传统的开腹手术有诸多优势,如创伤较小、患者所需的恢复时间短、并发症较少等优点,且具有诊断和治疗的双重效果,是目前在治疗宫外孕时最值得值得的治疗方法。

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡与自噬研究进展

RA是一种全身性的自身免疫病,其主要特征是滑膜的慢性炎症增生性改变,并伴有大量炎性细胞浸润.未经系统治疗的RA可反复迁延多年,后期可侵犯软骨和骨引起关节重塑,最终导致关节畸形而影响关节功能[1],严重威胁着人类的生命健康.RA滑膜成纤维细胞（RA synovial fibroblasts,RASFs）凋亡异常在RA的病变进程中起着关键作用,最终导致滑膜的增生和一系列病理改变[2].最近研究发现RASFs中自噬与凋亡存在相关性,抑制自噬后RASFs凋亡增多[3-4],自噬可能参与了RASFs凋亡调节.所以对RASFs凋亡与自噬的研究有助于为RA治疗提供新的思路.

甲氨蝶呤通过诱导自噬促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡机制的研究

目的明确甲氨蝶呤对RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)的作用机制,为RA的药物治疗提供新的理论依据。方法分离并培养RA-FLS,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测甲氨蝶呤作用下的细胞活力及细胞凋亡;不用浓度或不同时间点,甲氨蝶呤作用于RA-FLS,蛋白质印迹法及免疫荧光检测RA-FLS自噬的诱导情况;微RNA干扰(siRNA)Beclin1基因,流式细胞仪及PARP p85检测甲氨蝶呤作用下RA-FLS的凋亡情况;实验数据采用独立样本的t检验,GraphPad Prism 5.0软件绘制统计图。结果甲氨蝶呤可诱导RA-FLS细胞凋亡增加,增强RA-FLS自噬,诱导自噬体形成。在RA-FLS中,转染Beclin1基因的siRNA抑制自噬并增加甲氨蝶呤诱导的细胞凋亡。结论RA-FLS通过自噬抵抗甲氨蝶呤的促凋亡作用,甲氨蝶呤联合自噬抑制剂可增加RA的治疗效果。

MiR-103a-3p与miR-107:骨关节炎进展过程中的潜在生物标志物

目的探讨OA发病机制中潜在的Hub基因、关键miRNAs、生物过程及相关信号通路,为OA的发病机制及治疗提供生物信息学依据。方法从基因表达综合数据库(GEO)下载OA滑膜组织样本的表达谱芯片,鉴定差异表达基因DEGs,并进行功能富集分析。构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI),STRING和Cytoscape进行模块分析,进一步鉴定Hub基因,并对Hub基因进行更深一步的miRNAs挖掘。结果最终鉴定出与OA进展相关的9个Hub基因[细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)3、转导素重复序列包含蛋白(BTRC)、F-框蛋白32(FBXO32)、KLHL22、UBE3A、HUWE1、UBR4、ANAPC5、TRIM50]和2个关键miRNAs(hsa-miR-103a-3P、hsa-miR-107),可能是OA发病机制中的潜在生物标志物。信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控和蛋白丝氨酸/苏氨酸酶活性与OA的发病机制具有一定的相关性。此外,分析结果表明cAMP信号通路和Rap1信号通路也参与了OA的进展。结论潜在生物学分子、生物过程及相关通路对于OA的病因研究及治疗研究具有重要的指导意义。

软骨下骨硬化在骨关节炎发病机制中的作用研究

骨关节炎(OA)又称为退行性关节炎,是最常见的关节疾病,其病变主要包括软骨退变、软骨下骨的改变和滑膜的炎症。目前OA的发病机理尚不明确,既往许多研究都聚焦于关节软骨的退变,而近年研究报道软骨下骨硬化可能是OA的一个病因,发生在关节软骨退变之前。研究软骨下骨硬化在OA进展中的作用可以更全面地了解OA的发病机制,并为OA的治疗提供新视角。本文针对近年来关于软骨下骨硬化在OA发病过程中的作用研究进行综述,为后续基础研究及临床工作提供帮助。

生物信息学分析方法探讨类风湿关节炎患者滑膜病变中的免疫细胞浸润

目的探索RA滑膜病变中的免疫浸润细胞,为RA的机制及治疗研究提供新的研究方向及治疗靶点。方法从基因表达综合数据库(GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载GSE77298、GSE55457和GSE1919三个基因表达数据集,Perl进行数据合并,R的"limma"进行批次矫正。在R中用"CIBERSORT"软件通过"e1071""parallel"和"preprocessCore"3个包获得22种免疫细胞对应RA滑膜组织样本和正常滑膜组织样本的表达矩阵。Perl筛选免疫细胞矩阵中P<0.05的样本。R的"barplot"函数分析22种免疫细胞在P<0.05的样本中的含量百分比。R的"pheatmap"包可视化热图,R的"corrplot"包绘制相关性热图。R的"vioplot"包通过wilcox检验绘制差异小提琴图。结果免疫细胞浸润分析结果表明,在P<0.05的RA滑膜组织样本和正常滑膜组织样本中,初始B细胞和未活化的自然杀伤细胞在RA滑膜组织中低表达,浆细胞、未活化的肥大细胞、M1巨噬细胞、记忆性B细胞和调节性T细胞在RA滑膜组织中高表达。研究还发现在同一样本中,活化的自然杀伤细胞与中性粒细胞的相关系数(r=0.91)最高,呈正相关,两者具有协同效应。在同一样本中,M0巨噬细胞和浆细胞的相关系数(r=-0.88)最低,呈负相关,两者具有拮抗作用。结论本研究发现的RA滑膜病变中的免疫浸润细胞为RA的机制研究及治疗研究提供了一定的理论依据和研究方向。