粉尘螨α-烯醇化酶基因的克隆表达、纯化及其N端B细胞表位的初步鉴定

目的克隆表达粉尘螨(Dermatophagoides farinae)α-烯醇化酶(alpha-enolase,ENOA)基因,初步研究其N端B细胞表位与自身免疫性疾病的关系。方法 1设计特异性引物,从文库中克隆ENOA cDNA;2通过BamH I/EcoR I双酶切位点,将ENOA基因克隆至pET-His原核表达载体,表达纯化,获得了重组ENOA蛋白;3测定重组ENOA酶活性;4通过Swiss-Model软件模拟ENOA蛋白3D结构,并分析其潜在的N端B细胞表位;合成ENOA的N端表位肽,测定其与类风湿性关节炎患者血清IgG的反应性。结果 1克隆了ENOA全长cDNA(GenBank登录号KJ421213.1);2成功构建了pETHis-ENOA表达载体,经纯化获得了重组ENOA蛋白。3重组蛋白具有烯醇化酶活性;4瓜氨酸修饰的合成表位肽与类风湿性关节患者血清IgG-ELISA呈阳性反应,与健康对照组血清均不呈反应(P<0.05)。结论本课题首次克隆表达的重组ENOA蛋白具有烯醇化酶活性;其N端B细胞表位与类风湿性关节炎相关。本研究为尘螨与自身免疫性疾病的相关性研究提供了新的思路。

粉尘螨第24组过敏原cDNA克隆表达及其免疫学特性的研究

目的克隆表达粉尘螨第24组过敏原cDNA,研究其免疫学特性,为深入研究尘螨致敏机制提供基础。方法以粉尘螨cDNA文库为模板,根据Der f24基因序列(GenBank Accession No.KC669700)设计引物,PCR扩增Der f24cDNA,构建原核表达载体pET-His-Derf24,并经酶切鉴定和DNA测序,转化至E.coli BL21(DE3)plysS,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达;重组产物经Ni 2+螯合层析纯化,获得重组的Der f24(14kDa);对重组蛋白进行IgE-Western blotting(WB)实验和IgE-ELISA实验;通过Swiss-model软件模拟Der f24的3D结构并通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞表位,合成三个肽(位置分别为75-88aa、44-57aa和104-117aa)进行IgE-ELISA实验。结果克隆的Der f24基因cDNA序列全长为357bp,编码118个氨基酸(GenBank Accession No.KP064571);Der f24原核表达主要形式为不可溶的包涵体,纯化后的重组Der f24蛋白分子量约为14kDa。IgE-WB结果显示,重组Der f24与10例粉尘螨过敏患者血清呈强阳性反应,而与10例健康对照组均为阴性。IgE-ELISA结果显示,合成表位肽(No.1 75-88aa:Z=5.6734、No.2 44-57aa:Z=5.6720和No.3 104-117aa:Z=5.6791;P<0.0001)均与22例粉尘螨过敏患者血清呈阳性反应,而与22例健康对照组血清呈阴性反应。结论本研究成功克隆表达了Der f24cDNA,重组Der f24可结合粉尘螨过敏血清IgE,鉴定了3个潜在的IgE B细胞表位。本研究为进一步防治螨性过敏性疾病奠定了技术基础。

槲皮素对内分泌耐药乳腺癌三苯氧胺治疗增敏作用的体内研究

目的:探讨槲皮素(QUE)对内分泌耐药乳腺癌三苯氧胺(TAM)治疗的增敏作用。方法:用大剂量TAM冲击法构建TAM耐药乳腺癌细胞株MCF-7/TAM-R并移植裸鼠后,将荷瘤鼠随机分为4组,分别给予溶媒(对照组)、QUE 50 mg/kg 1次/2 d(QUE组)、TAM 5 mg/kg 1次/d(TAM组)、QUE 50 mg/kg 1次/2 d+TAM 5 mg/kg 1次/d(QUE+TAM组)处理,动态观测各组荷瘤鼠的一般情况与瘤体体积的变化,于给药21 d后,处死各组荷瘤鼠,检测瘤体质量及瘤组织ERα、HER-2、pMAPK、MAPK、pAkt、Akt蛋白的表达。结果:给药过程中,QUE+TAM组和QUE组裸鼠摄食减少、体质量减轻,对照组与TAM组裸鼠无明显异常;至第12天开始,QUE+TAM组瘤体生长呈下降趋势,且第21天明显下降(P<0.05),其余各组瘤体均呈持续增长。与对照组比较,QUE+TAM组瘤体质量明显减轻(P<0.05),而其余两组均无统计学差异(均P>0.05);QUE+TAM组和QUE组瘤组织中ERα蛋白高表达,HER-2、pMAPK、pAkt蛋白低表达,而TAM组上述蛋白表达均无明显差异,各组非磷酸化的MAPK、Akt蛋白表达均无明显差异。结论:QUE能恢复内分泌耐药乳腺癌对TAM的敏感性,可能与其下调HER-2及其下游信号pMAPK、pAkt的表达,并上调ERα的表达有关;QUE有潜在的毒副作用,其安全范围及有效剂量有待进一步探讨。