人红细胞生成素全基因的化学合成及克隆

利用DNA合成技术,设计并合成人红细胞生成素(EPO)的全基因,EPO基因全长600 bp.首先合成32个小片段,经纯化后分别连接成相应的3个基因大片段,再将3个基因大片段组装成1个完整的EPO基因。用双脱氧末端终止法对基因大片段及全基因进行DNA序列分析,结果表明化学合成的基因序列与最初设计的EPO基因序列完全一致。

人脐血干细胞移植促进大鼠脊髓损伤神经恢复

目的观察移植人脐血CD３４＋干细胞是否可以存活、分化、促进脊髓损伤的行为和功能恢复。方法２６只Wister大鼠随机分成移植组和对照组。移植组行脊髓半切术并移植５-溴脱氧尿核苷（Brdu）标记的脐血CD３４＋细胞，对照组行脊髓半切术后注射PBS液。采用改良Tarlov评分标准对移植组和对照组所有大鼠在术前和术后２４h、１、２、３、４周进行运动功能评价。组织学和免疫组化分析移植细胞的定位和分化情况。结果移植后在脊髓病理切片中出现Brdu标记人脐血细胞，激光扫描共聚焦显微镜通过免疫荧光双标检测到７％Brdu阳性细胞表达神经胶质元纤维酸性蛋白（GFAP），２％Brdu阳性细胞表达神经元核抗原（NeuN）。神经功能检测发现１周后移植组功能恢复较对照组具有显著性差异（P＜０．０５）。结论移植人脐血干细胞可以促进脊髓损伤的行为和功能恢复，为神经损伤治疗提供了有用的细胞源。

PF4对造血干/祖细胞系KG1a总粘附性、粘附分子表达及细胞骨架蛋白聚合的作用

目的研究ＰＦ４单用及与ＩＬ－３联合应用对造血干／祖细胞系ＫＧ１ａ总粘附性、粘附分子表达及细胞骨架蛋白聚合的影响。方法采用结晶紫染色、免疫标记流式细胞仪测定、ＭＴＴ、荧光分光光度等方法。结果１．单用１００ｎｇ／ｍｌ ＰＦ４作用于ＫＧ１ａ细胞时，ＫＧ１ａ细胞总粘附性增长８０％，单用２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３作用于ＫＧ１ａ细胞时，ＫＧ１ａ细胞总粘附性增长９６％，ＰＦ４与ＩＬ－３联合作用于ＫＧ１ａ细胞时，ＫＧ１ａ细胞总粘附性增长９７％。２．ＰＦ４作用于ＫＧ１ａ后，ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ表达分别增加了２１％、２２％、１７％、１８％，较前均有显著性（Ｐ＜０．０５＝，而ＰＦ４对ＫＧ１ａ细胞的ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６２Ｅ表达无影响；ＰＦ４与ＩＬ－３联合作用于ＫＧ１ａ时，ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ表达并没出现互相促进作用。３．分别用抗ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ等单克隆抗体阻断ＫＧ１ａ粘附分子时，对ＰＦ４引起的ＫＧ１ａ粘附性分别下调了３９％、４３％、３４％、３８％。４．ＰＦ４、ＩＬ－３作用ＫＧ１ａ细胞时，能够引起ＫＧ１ａ细胞肌动蛋白的聚合。结论ＰＦ４可刺激早期的白血病性造血干／祖?

胚胎脊髓细胞悬液在大鼠损伤脊髓中的突触发育过程

目的 观察分析胚胎脊髓细胞悬液在损伤脊髓移植区中的突触发育过程。 方法 对 4 2只 Wistar成年大鼠以改良 Allen法 (10 g× 5 cm)打击脊髓 ,3天后将孕 14天 (E14 ) 5只胚胎脊髓细胞悬液 (FSCS) 2 0 μl植入损伤空腔 ,移植后 2、4、6、8、10和 12周 ,以组织学、免疫组织化学观察移植物成活、分化及其与宿主之间关系。 结果 移植区成神经细胞最先展示了胞质突起 ,随之出现了低电子密度的突触前后膜 ,突触前、后膜电子密度逐渐增高形成良好的致密突起。突触小泡数量和种类逐渐增多 ,突触小泡有圆形清亮小泡、椭圆形小泡、颗粒状小泡和扁平小泡 - f型。突触的连接方式由单个的胞体 -树突突触 ,出现多个的胞体 -树突和树突 -树突突触。同时 ,移植成神经细胞、成少突胶质细胞及成星形细胞的细胞器日渐完善 ,细胞功能活跃。血脑屏障也随之出现。移植区可见神经微丝 (NF)、组织胺 (5 - HT)、降钙素基因相关肽 (CGRP)、胶原纤维酸性蛋白 (GFAP)阳性纤维。 结论 胚胎脊髓细胞悬液在成年大鼠损伤脊髓内可发育为成熟的突触 ,显示了 FSCS与宿主脊髓重建突触方式的信息交换的潜在可行性。

人凝血酶敏感蛋白1抗血管生成活性片段重组腺病毒高效制备

目的构建人凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1,TSP1)抗血管生成片段重组腺病毒。方法采用RT-PCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增编码TSP1抗血管生成活性片段(TSP1f)的cDNA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV上,以线性化重组穿梭载体与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组并酶切鉴定筛选正确重组子,用线性化重组质粒转染人胚肾293细胞,制备重组腺病毒ADV-TSP1f,最后以PCR及Westernblot方法鉴定TSP1抗血管生成片段的表达。结果细菌内同源重组共获得43个卡那霉素抗性克隆,经酶切鉴定表明其中直径最小的10个均为正确重组子,该重组质粒转染293细胞所获得的重组腺病毒可高效表达TSP1抗血管生成片段,纯化后病毒滴度为1.0×1011pfu/mL。结论细菌内同源重组法构建重组腺病毒高效快捷,所获得的ADV-TSP1f可进一步应用于抗肿瘤血管生成的基因治疗研究。

卵巢肿瘤端粒酶活性及其催化亚基hTERT mRNA表达的相关性研究

目的:研究端粒酶激活及其催化亚基的表达在卵巢肿瘤的发生、发展中的意义。方法:采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附法(Trap-ELISA)及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定端粒酶活性并观察hTERT mRNA表达。结果:3株卵巢癌细胞系端粒酶活性均呈高水平表达,同时hTERT mRNA亦呈高表达;端粒酶阳性率在癌、交界性卵巢肿瘤中分别为74.19％、2/4,在良性及正常卵巢组织中未检测出活性。各组间有显著性差异(P<0.01)。hTERT mRNA仅卵巢癌中表达,阳性率为61.79％;端粒酶阳性率及hTERTmRNA表达率均随手术分期的增高而增高(P<0.01)、卵巢肿瘤端粒酶阳性率及hTERT mRNA表达率呈正相关。结论:端粒酶的激活及其催化亚基的表达与卵巢癌的发生和进展密切相关,二者有望成为卵巢癌预后判断的新指标及基因治疗的新靶点。

抗人纤维蛋白单链抗体的人源化

目的：人源化抗人纤维蛋白单链抗体，降低人抗鼠抗体反应。方法：从人免疫球蛋白基因数据库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体ｓｃＦｖ－８Ｅ５重链（ＶＨ－８Ｅ５）和轻链（ＶＬＳＭ）同源性最高的序列，作为人源化改造的框架，其中植入ｓｃＦｖ－８Ｅ５的互补决定区。人工合成其ＤＮＡ片段，用ＤＮＡ连接酶连接成完整的人源化ＶＨ－８Ｅ５和ＶＬ－８Ｅ５，构建表达载体，转化ＪＭ１０９后用ＩＰＴＧ诱导表达，ＥＬＩＳＡ测定其抗原结合活性。结果：表达产物分子量３０ｋＤ左右，人源化ｓｃＦｖ－８Ｅ５与亲本抗体ｓｃＦｖ－８Ｅ５抗原结合活性无明显差别，可耐受至少２ｗ，４℃保存，数次反复冰融或一定时间的３７℃孵育。结论：人源化ｓｃＦｖ－８Ｅ５具有特异性识别人纤维蛋白的活性，鼠源ｓｃＦｖ－８Ｅ５的人源化基本获得成功。

随机扩增多态性DNA对新生儿病房产气肠杆菌基因分型

目的:建立产气肠杆菌随机扩增多态性DNA(RAPD)分析技术,用于新生儿病房产气肠杆菌流行病学调查。方法:对从新生儿病房两次集中分离出的产气肠杆菌进行抗生素最低抑菌浓度试验(MIC)和RAPD分析,结合患儿的临床及流行病学资料进行分析。结果:药敏谱分型与RAPD分型不完全一致。16株产气肠杆菌的RAPD分型分为9型。RAPD分型为Ⅰ、Ⅲ、Ⅷ型的10株产气肠杆菌是流行相关菌株,均为医院内获得,分别导致3次各不相关的水平传播。结论:药敏谱分型不能很好地区分菌株的株间差异。RAPD分型准确、操作简便,在48h内可确定流行株,是研究产气肠杆菌分子流行病学的有力工具。

RAPD用于新生儿病房产气肠杆菌分子流行病学研究

目的建立产气肠杆菌RAPD技术,用于新生儿病房产气肠杆菌分子流行病学研究。方法在具有10张床位的新生儿病房,于同一时间采自4例同期住院患儿分离出5株产气肠杆菌,做RAPD分析及药敏试验,找出流行相关菌株及分析耐药情况。结果两株具有相同RAPD指纹图谱的产气肠杆菌是流行相关菌株,分别采自住院第4天和第10天的两例患儿,在新生儿病房内获得;所有菌株不同程度地对氨基苷类、哌拉西林、三代头孢菌素耐药。结论RAPD技术为产气肠杆菌分子流行病学研究提供了简便、可靠的手段,菌株的耐药情况可能与标本采集之前抗菌药物的应用有关。

hTERT基因反义cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响

目的 :研究反义hTERT基因对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响。方法 :构建反义hTERT基因的真核表达载体 ,采用LIPOFCTAMINETM Reagent转染卵巢癌细胞系SKOV3,通过RT PCR、Trap ELASA、生长曲线、裸鼠体内致瘤能力等方法比较转染前后细胞hTERT基因表达、端粒酶活性、细胞生长、致瘤性等方面的变化。结果 :转化细胞系细胞hTERT基因的表达受到抑制 ,端粒酶活性下调 ,肿瘤细胞的增殖与生长速度明显降低 ,细胞的克隆形成能力及裸鼠体内的成瘤能力下降 ,肿瘤的恶性表型部分逆转。结论 :应用反义技术下调hTERT基因表达可有效降低端粒酶活性并部分逆转卵巢癌细胞的恶性表型 ,hTERT基因可望成为卵巢癌基因治疗的新靶点。

bcr/abl基因b3-a2型接合区cDNA的分离和序列分析

利用分子生物学方法,我们将K562细胞林bcr/abl mRNA 0.3kb的接合区cDNA片段用聚合酶链反应扩增并插入到质粒pGEM-4-Z载体中。经限制酶切分析和荧光标记M13引物法DNA序列测定,证实重组质粒pB3A2中有0.3kb的插入片段与K562 mRNA接合区序列完全一致。我们分离到的接合区DNA可用于bcr/abl基因的检测及其反义核酸抑制的研究。

我国异常Hb的研究Hb H及Hb E-复合β-地中海贫血的化学结构及其红细胞可变形性的研究

对3例切脾患者的Hb进行醋酸纤维素薄膜电泳检查,例1,2Hb溶液含有一条相当于HbH的快速带;例2尚具有一条可以分辨的相当于Bart’s的快带;

抗肿瘤的PF4及相关肽基因重组腺病毒的构建

利用细菌内同源重组法构建含PF4(血小板第四因子)全长1-70及PF4的小肽17-70基因的重组腺病毒。方法:将连有MCP-1信号肽的PF4全长及其C末端的改构体PF4-17-70两个基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdshuttle-CMV中,形成转移质粒pAdshuttle/PF4(1-70)和pAdshuttle/PF4(17-70),将之酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提并鉴定含目的基因的重组体质粒,而后用磷酸钙共沉淀方法转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒AdPF4(1-70)和AdPF4(17-70)。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,扩增并纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度,利用带有CMV-LacZ的对照重组腺病毒(Ad-LacZ)对感染效率进行监测。结果:利用电穿孔法分别将质粒pAdshuttle/PF4(1-70),pAdshuttle/PF4(17-70)与质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得70%以上的阳性重组体细菌克隆。PCR检测结果表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1×1010pfu/ml。结论:利用细菌内同源重组法可以简便、快捷地构建含PF4(1-70)、PF4(17-70)cDNA的腺病毒载体,为两者在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。

血小板生成素改构体基因的克隆和序列分析

采用PCR技术 ,根据文献报道的鼠TPO成熟肽基因序列 ,设计并合成两对引物 ,以鼠TPOcDNA为模板 ,扩增获得mT PON端 15 3个氨基酸的 4 78bpcDNA片段及鼠TPO全长 10 32bpcDNA片段 ;mTPO15 3片段与合成的碱性成纤维生长因子序列中Lys119-Lys135aa的 5 1bp肝素结合位点DNA片段连接 ,克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序 ;同时将扩增的鼠TPO全长cDNA片段克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序 ,证明获得鼠血小板生成素与肝素结合位点基因及鼠TPO全长基因 ,继之以pMAL -C2X为表达载体构建表达质粒 。

血小板第四因子在原核中的高效表达、分离纯化及活性测定

构建重组表达质粒pET - 32c PF4 ,并在原核中进行表达 ,以探讨其对白血病细胞系 (HEL)细胞增殖的作用。方法 :通过PCR方法从含有PF4基因的PQE - 6 0 PF4质粒中扩增PF4 ,用NcoⅠ HindⅢ双酶切 ,克隆到原核表达质粒pET - 32C中 ,使之在BL2 1表达 ,Ni-ChelatingSepharose亲和柱纯化 ,用细胞集落形成方法研究重组PF4对HEL的抑制作用。结果 :菌株筛选后在大肠杆菌中获得可溶性高效表达 ,重组PF4占菌体总蛋白的 2 2 %。肠激酶酶切除去N -端融合部分 ,获得了高纯度的重组人血小板第四因子 (rh -PF4 ) ,纯度为 95%以上。活性实验发现重组PF4可抑制HEL细胞集落的形成 ,抑制率为 4 7%。结论 :原核表达质粒pET - 32C可高效可溶性表达PF4 ,重组PF4对HEL细胞的增殖有抑制作用。

水蛭素变异物1基因克隆与表达

Haycraft于1884年发现医用水蛭提取物中有抗凝物质。50年代末,Mark-Warat首次分离出纯品,命名为水蛭素(Hirudin)。水蛭素是至今为止所发现的凝血酶最有效最特异的天然抑制剂。

用电击孔法转染人红细胞生成素基因

用电击孔(electroporation)转染方法已成功地使化学合成的红细胞生成素(EPO)基因在猿猴肾细胞(COS-7)中表达。对转染条件、表达质粒(pSVL-EPO)DNA含量及转染后不同时间表达产率的观察和研究表明:电击孔缓冲液及相应电压的选择与表达产率有关,且表达质粒DNA量在50～100μg,转染细胞存活率在50％左右时,表达效果好。在转染后24h,便可在细胞上清液中测到EPO活性,48～72h达高峰,EPO活性可达9.7U/ml。

应用非放射性标记探针原位杂交检测BCR/ABL基因表达

选择BCR/ABL cDNA 0.3kb的接合区序列,标记Biotin-14-dCTP,与慢性粒细胞白血病(CML)患者的细胞涂片原位杂交,链霉亲和素-碱性磷酸酶显色系统检测,建立了原位杂交检测BCR/ABL基因表达的方法。对3例非CML的血液病患者(对照组)、18例CML初诊和8例治疗后的CML患者骨髓进行检测。CML初诊患者17/18为阳性,1例阴性反应来自Ph染色体阴性型患者,CML治疗后患者BCR/ABL mRNA表达3/8为阳性,5/8为阴性。结合各例骨髓增生活跃程度,表明BCR/ABL基因表达水平可以反映治疗效果。

人及小鼠干细胞因子cDNA克隆的分离与鉴定

干细胞因子(SCF)是作用于早期多能造血干细胞的调控因子。不同的作者对这种因子有不同的命名,然而它们的生物学作用相同,都是c—kit编码蛋白的配体,它们的cDNA序列基本相同,因而证明是同一种物质。我们利用RT-PCR方法,从我室自己建立的三株基质细胞系中扩增出SCF活性部分的cDNA序列,并成功地克隆入载体,为进一步表达SCF并探索它的生物学新功能和作用机制提供了保证。

人红细胞生成素基因在小鼠体内的表达

将构建的重组逆转录病毒载体PN_2-EPO导入包装细胞PA317中,整合了病毒基因组的PA317细胞能稳定地分泌PN_2-EPO病毒颗粒。将经5-氟脲嘧啶处理的供体小鼠骨髓细胞,在polybrene存在下,与产病毒的PA317包装细胞共同培养48h后,取悬浮细胞静脉注入受致死剂量照射的同系小鼠体内,10～14天后取脾脏细胞,提取RNA。RNA点杂交表明,EPO基因已在小鼠体内的造血细胞中得到转录表达。