生物工程专业微生物学自主设计性实验教学之初探

微生物学是生物工程专业的一门重要的理论课,同时也是一门实验科学,微生物学自主设计实验,让学生根据已经学习和了解的微生物学知识及微生物学实验的基本理论,结合每个学生自己的兴趣与爱好,设计并完成一个与生物工程专业相关的微生物学实验方案,并撰写小论文。通过自主设计实验的设计与实施,使学生切身体会到了独立做科研的感受,为将来从事科学研究奠定了基础。

利用DNA免疫技术制备ASB11蛋白的多克隆抗体

ASB11参与胚胎神经祖细胞的发育、再生性肌发生以及泛素化等过程,但其机制仍不清楚。为了进一步研究斑马鱼Asb11基因的作用机制,本研究采用DNA免疫技术制备了ASB11多克隆抗体;利用斑马鱼Asb11的c DNA构建p CAGGS-P7/ASB11重组表达质粒,肌肉注射入6-8周龄的BALB/c小鼠体内,诱导抗原蛋白的表达和免疫应答的发生。结果显示,制备的p CAGGS-P7/ASB11重组质粒具有较好的免疫原性;将提取的抗血清进行Western-blot和免疫荧光检测,显示所制备的多克隆抗体抗体效价为1∶400,抗血清抗体能特异的结合ASB11蛋白。本研究为后续的功能研究奠定了基础。

RMND5B基因的克隆及其腺病毒载体的构建

已有研究表明RMND5B可能与心肌肥大相关,但具体机制不明,RMND5B的重组腺病毒载体的构建和鉴定为研究RMND5B功能提供了基础工具。首先,设计小鼠RMND5B基因的特异性引物,以c DNA为模板,PCR扩增RMND5B ORF区,并在两端各加入HindⅢ及SalⅠ的酶切位点。将此片段插入到p MD18-T载体,再亚克隆至线性化的穿梭质粒p Ad Track-CMV中。PmeⅠ酶切线性化之后,电转化到含p Ad Easy-1的BJ5183感受态细菌中。在BJ5183细菌中发生同源重组获得了重组质粒p Ad-RMND5B质粒。PacⅠ酶切线性化之后转染293A细胞,经过包装获得腺病毒AdRMND5B。将此腺病毒感染新生大鼠原代心肌细胞,并在一段时间后观察绿色荧光并通过RT-PCR检测RMND5B的表达情况。结果表明,成功构建了RMND5B的重组腺病毒载体并实现了AdRMND5B在新生大鼠原代心肌细胞中表达,为进一步研究RMND5B基因在心肌肥大中的作用奠定了良好的实验基础。

2009-2022年海南省人间布鲁氏菌病流行病学特征分析

目的 分析海南省2009-2022年人间布鲁氏菌病(布病)的流行病学特征,为制定针对性的布病预防控制策略提供依据。方法 收集中国疾病预防控制信息系统中海南省2009-2022年人间布病报告数据和各监测点血清学监测数据,进行描述性流行病学分析。结果 2009-2022年海南省共报告布病140例,年均发病率为0.11/10万,发病率呈逐年上升趋势(χ^(2)=164.602,P<0.001)。发病以3-8月为主。全省17个市(县)(17/19,89.47%)有布病病例报告,以东方市、昌江黎族自治县、白沙黎族自治县、乐东黎族自治县、临高5个邻近的市(县)发病水平最高,发病市(县)数呈逐年增加趋势。男性年均报告发病率为0.13/10万,女性年均报告发病率为0.07/10万,差异有统计学意义(χ^(2)=21.174,P<0.001)。以30~69岁人群为主,占全部病例的77.85%。职业分布以农民为主,占53.57%。共开展重点职业人群血清学监测13 175人,检出阳性161例(阳性率1.22%)。养殖牛、羊、猪等家畜,肉类加工及屠宰等直接接触病畜及污染物等为感染的主要原因,占95.00%,食源性感染占2.86%。77.14%的病例在发病30 d内就诊。结论 海南省人间布病的发病率呈逐年上升的趋势,迅速扩散到多个市(县),建议相关部门加强联防联控,根据流行病学特征,采取适当的控制措施。

海南省2022年emm12型A族链球菌基因组及药物敏感性特征分析

目的 了解海南emm12型A族链球菌(group A Streptococcus, GAS)基因组特征及对目前常用抗菌药物的敏感性,为猩红热等GAS相关疾病提供病原学数据。方法 基于2022年海南省呼吸道症候群监测获得的咽拭子分离GAS菌株,应用高通量测序技术对所分离菌株进行基因组测序和emm基因分型、基因多位点序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)、耐药基因与毒力基因预测,利用MEGA 10.1.8最大似然法(maximum likelihood, ML)绘制系统进化树。采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)进行药敏试验。结果 2022年海南呼吸道症候群监测分离的4株GAS分离株均为emm12/ST36型,毒力基因除emm基因外,共检测到7种超抗原基因speB(100%)、speI(75%)、speH(75%)、speC(100%)、ssa(100%)、sme Z(100%)、speG(100%)。所有菌株均携带大环内酯类耐药基因ermB和ermTM、四环素耐药基因tet(M),均不携带耐药基因mefA,对红霉素、克林霉素、四环素耐药率100%,对青霉素仍保持高度敏感。系统进化树分析显示,海南分离株均集中在同一分支上。结论 2022年海南GAS优势基因型为emm12型,MLST分型与emm分型具有一致性。携带的耐药基因与药敏实验结果一致,海南地区青霉素等β-内酰胺类药物可继续作为GAS临床治疗首选药物,需扩大菌株量进一步监测。

2022年海南省新型冠状病毒奥密克戎(BA.1.1)变异株基因特征分析

为进一步积累和完善海南省新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)奥密克戎(Omicron)变异株病原学特点的认识,本研究对2022年海南省14例感染奥密克戎(BA.1.1)变异株病例进行新冠病毒基因特征分析。应用Illumina公司MiSeqDX深度测序平台进行全基因组序列测定,Nextclade在线分析平台和DNASTAR 7.0.1生物信息学软件进行多序列比对和基因组特征分析,采用MEGA 10.1.8邻位归并法(Neighbour-joining)绘制系统进化树,结合流行病学调查进行回顾性溯源分析。海南省14例病例感染的奥密克戎(BA.1.1)变异株基因组高度相似,同武汉参考序列(GenBank No.NC_045512)相比,存在63或64个核苷酸突变位点,39个核苷酸位点缺失,22204位点有9个核苷酸插入,引起43个氨基酸突变和16个氨基酸位点缺失。刺突(Spike,S)蛋白存在32个氨基酸突变位点,S1蛋白RBD区R346K是VOC/Omicron(BA.1.1)变异株特征性突变位点。14例病例分布在三亚市及外溢到周边陵水、儋州等市县,均为外省来琼感染者引发后续本地传播。海南省因输入病例引起本土新冠疫情的风险较大,应继续加强新冠病毒重要流行变异株的研究,持续开展新冠病毒基因型变异监测。

基因编辑技术在斑马鱼中的应用及研究进展

基因编辑技术通过对特定DNA片段的插入、敲除、修饰或替换等,实现对生物体中目标基因的编辑。与早期基因工程技术将遗传物质随机插入宿主基因组中的方式不同的是,基因编辑技术能够定点需要插入的位置,从而实现对生物体基因组特定位点的准确修饰、人为地改造生物体的遗传信息,目前广泛应用于斑马鱼的基因组学、遗传发育和基因功能研究中。其方法包括诱变技术、Tol2转座子、Morpholino、ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas系统等。本研究主要介绍了基因编辑技术的作用机理与发展概况。作为一种精准而高效的基因工程方法,基因编辑技术在近年来得到了飞速地发展。它既可以采用对特定基因的靶向突变来研究基因的功能,也可以通过将功能性基因插入并替代缺陷基因而用于某些遗传性疾病的基因治疗。可以肯定的是,基因编辑技术未来将在基础生物学、医学、生物技术等多个领域具有重要的研究价值和应用价值。

湘莲中产耐酸性α-淀粉酶菌株的分离及鉴定

目的从湘莲中分离产耐酸性α-淀粉酶菌株,并对其进行鉴定。方法采用淀粉富集培养基分离湘莲中产α-淀粉酶菌株,通过形态学、生理生化分析及16S rDNA序列分析进行鉴定;在不同pH(3.20、3.38、3.56、3.85、4.15和4.45)条件下培养筛选出的菌株,测定酶活力,确定产酶的最适pH;在不同温度(25、30、35和40℃)条件下培养耐酸性α-淀粉酶产生菌,测定酶活力,确定产酶的最适温度;用不同碳源(蔗糖、淀粉和葡萄糖)和不同氮源[牛肉膏、(NH4)2SO4、柠檬酸氢二铵、柠檬酸三铵和蛋白胨]培养耐酸性α-淀粉酶产生菌,测定酶活力,确定产酶的最适碳源和氮源。结果从湘莲样品中筛选出2株酶活力较高的菌株,酶活力分别为376.21和395.62 U/ml,分别编号为LL5和LL9,2株菌株均为解淀粉芽胞杆菌。菌株LL5产α-淀粉酶的最适pH为3.56,最适温度为34℃,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为柠檬酸三铵,为耐酸性α-淀粉酶产生菌。结论成功从湘莲中分离出1株产耐酸性α-淀粉酶菌株LL5。

羊种布鲁氏菌分离株体外抗生素敏感性研究

目的为研究布鲁氏菌临床分离株常见抗生素的敏感性。方法本研究利用肉汤稀释法检测布鲁氏菌临床分离株对临床常见布鲁氏菌病治疗药物的最小抑菌浓度(MIC),并利用单因素方差分析比较不同分离省份的菌株药物敏感性差异。结果在现有的布鲁氏菌耐药拐点下,本研究涉及的布鲁氏菌临床分离株常见治疗药物的MIC均在敏感范围内,其中多西环素(0.06~0.12μg/mL)、四环素(0.06~0.25μg/mL)、庆大霉素(0.015~0.03μg/mL)的MIC范围较低;分析分离株氨苄西林MIC值发现,四川省与陕西省(P=0.0001)、河北省(P=0.0001)和湖南省(P=0.04)均差异显著,河北省与广东省(P=0.02)差异显著。另外,本研究还发现了红霉素(32μg/mL)、复方新诺明(0.25/4.8μg/mL)MIC值较高的分离株。结论本研究涉及的布鲁氏菌临床分离株对临床常见治疗药物敏感,但部分分离株对复方新诺明等的敏感性较低,应加强监测,防止菌株耐药。本研究为我国布鲁氏菌耐药水平监测提供基础数据,同时为抗性菌株的筛查及防控提供思路。

2021年海南省2例轻型新冠肺炎病例相关新冠病毒德尔塔变异株的分子特征分析

本文对2021年海南省2例感染引起本土轻型新冠肺炎病例的新冠病毒进行全基因组测定和序列分析,研究该病毒的分子特征和分子进化规律。通过荧光定量RT-PCR法检测ORF1ab和N靶基因,应用Illumina公司的MiSeq深度测序平台进行全基因组序列测定,使用MEGA 10.1.8和DNASTAR 7.0.1生物信息学软件进行多序列比对和分析,并采用邻位归并法(Neighbour-joining)绘制系统进化树。2例新冠病毒(HN0801和HN0802)均属于德尔塔变异株,与武汉参考序列(NC_045512)基因序列相似性分别为99.7%和99.8%,系统进化树显示它们位于同一进化分支(B.1.617.2)的不同簇上,共有45个核苷酸突变位点,引起38个氨基酸位点改变,其中34个错义突变、6个同义突变、4个氨基酸位点缺失;刺突(S)糖蛋白发现B.1.617.2谱系共同突变特征L452R、T478K,以及T19R、G142D、D614G、P681R、D950N、R158G关键变异位点。HN0801同2021年7月江苏省南京市代表株基因序列100%相似,而HN0802与南京市疫情代表株基因组相似性较低。结合流行病学调查和基因组序列分析,这2例新冠病毒均属于新冠病毒德尔塔变异株,2例确诊病例之间没有明确的流行病学关联,为两条不同的传播链引起的相互独立的散发病例。本研究为海南省新冠病毒变异株的监测和新冠疫情防控提供了基础数据。

DSBs修复通路的选择及其影响因素

DSBs（DNA双链断裂）是细胞DNA在内外各种因素影响下产生的一种严重损伤,也是包括肿瘤在内的多种疾病发生发展的重要原因之一。为修复该损伤,机体形成了包括同源重组（HR）、非同源末端连接（NHEJ）等在内的多种修复通路;在不同情况下,机体对修复通路的选择受到多种因素的影响。近年来的研究表明,包括细胞类型、末端切除、细胞周期、损伤原因、损伤位置等在内的诸多因素对修复通路的选择均起到了重要的作用。本综述介绍了DSBs修复的常见通路,并对DSBs修复通路的影响因素的最新研究进展进行了综述。