CpG ODN佐剂序列的筛选及其免疫刺激活性研究

目的设计和筛选对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列，研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂。方法根据具有免疫刺激活性的CpGODN序列结构特点，设计并合成出15条候选序列，分别合成并进行非硫代和硫代修饰。分选健康人PBMC细胞及Balb／c小鼠脾细胞，以不同CpGODN进行体外刺激，MTT法检测CpGODN诱导细胞增殖水平。随后将筛选出的有效CpGODN序列与人类基因组序列进行同源性比较，以评估其安全性。结果在刺激人PBMC和小鼠脾细胞72h后，硫代和非硫代修饰的15条序列A值均高于阴性对照组，其中IMB—AC5序列刺激人PBMC后A值分别达到0．377和0．334，与阳性对照ISS1018序列A值（0．387和0．338）接近；刺激小鼠脾细胞72h后，A值同样高于其他序列，达到0．571和0．486，与阳性对照ISS1018序列A值（0．588和0．464）接近。综合上述结果，选择5号非硫代序列作为候选佐剂。同源性比较结果显示，该序列与人类基因组序列没有同源性，与部分蛋白编码基因的同源性只有50％～65％，此外其部分序列与人18号染色体上的一些重复序列有同源性，最高同源性达62％。证明筛选出的新型CpGODN佐剂IMB—AC5安全性较高。结论设计筛选出对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列IMB—AC5，与人类基因组序列具有较低同源性，为进一步研发人用疫苗佐剂奠定基础。

白喉菌株主要抗原基因遗传稳定性及相应抗原蛋白结构确证的研究

对白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)主要保护性抗原基因序列的遗传稳定性进行研究,对相应的抗原蛋白结构进行确证,并进一步验证此前一代测序的结果,为疫苗的安全性和有效性提供依据。采用二代测序技术(next generation sequencing,NGS)对白喉棒状杆菌主代代次(P3)、工作代次(P7)、疫苗代次(P12)及疫苗代次后连续传3代的第3代样品V3代次(P15)的主要抗原基因序列进行测序并分析,并用Phyre 2软件预测出白喉毒素结构与文献发表的白喉毒素结构模型进行比对分析,采用蛋白免疫印迹(Westen blot,WB)试验对蛋白结构进行确证。结果显示,白喉棒状杆菌主要抗原基因序列最高突变率位点,主代代次为A_(580) C 0.46%、A_(868) C 0.46%,工作代次为A_(580) T 0.47%,疫苗代次为T_(507) G 0.64%,V3代次为位点T_(507) G 0.49%,其中主代代次、工作代次最高突变位点在B肽链的T区(α-螺旋区)内,不是主要抗原表位区;疫苗代次和V3代次最高突变位点在A肽链的C区(催化区)内,是主要抗原表位区域,但突变率较低,小于1%。36个能影响白喉毒素进入细胞和催化活性的碱基位点中,442碱基位点的各代次均比其他位点偏高(0.41%),其他位点均小于0.45%;蛋白结构模型预测与文献一致,均包含3个结构功能区;WB试验中,在58 kDa处均出现条带,大小与预期一致,说明此蛋白结构正确。传代过程中白喉主要碱基位点突变率较低,结构正确,说明白喉棒状杆菌菌种基因遗传稳定性好。

肠道病毒71型体外感染树鼩肾细胞特性观察

目的探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性。方法通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞,观察细胞形态并进行传代培养,利用细胞角蛋白18对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定。用EV71感染树鼩肾细胞,通过倒置显微镜观察细胞病变情况,结合间接免疫荧光实验观察细胞中病毒蛋白的表达情况,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒载量,以Vero细胞为对照,研究EV71对树鼩肾细胞的感染情况。结果通过组织块贴壁法可以快速获得树鼢原代肾细胞,并可进行多次传代培养,细胞为梭形,贴壁呈铺路石状,免疫荧光鉴定为肾上皮细胞。EV71可以感染树鼩肾细胞,使之出现明显的细胞变圆、脱落或解体等病变,免疫荧光实验可以观察到病毒蛋白的分布,实时荧光定量PCR检测病毒载量最高可达10~5拷贝/mL,病变情况和增殖趋势与Vero细胞相似。结论 EV71可以体外感染树鼩肾细胞,该细胞模型可为EV71药物筛选和感染机制研究提供平台。

DTacP-sIPV联合疫苗在模拟运输振动条件下的稳定性评价

目的评价组分无细胞百日咳-白喉-破伤风(百白破)(diphtheria,tetanus,component acellular pertussis,DTacP)-Sabin株灭活脊髓灰质炎病毒(Sabin strain inactivated poliovirus,sIPV)联合疫苗在模拟运输振动条件下的稳定性.方法选取3批DTacP-sIPV,设计振动条件模拟疫苗运输过程进行稳定性评价.分别于振动前和振动后取样,按照中国药典2020年版三部和内部制造检定规程要求进行成品检测(包括外观、装量、pH、渗透压摩尔浓度、铝含量、游离甲醛含量、戊二醛含量、鉴别、sIPVD抗原含量、百白破效价、无菌、内毒素含量、特异性毒性、异常毒性和毒性逆转检测)、sIPV效力试验、Zeta电位测定、上清液中抗原测定及电子显微镜观察.结果振动前后,3批DTacP-sIPV的检测结果均符合质量标准要求,百白破效价与D抗原水平以及sIPV效力试验结果差异无统计学意义(t值分别在0.21~0.73、0.05~1.34和0.16~1.90,P值均>0.05);Zeta电位以及上清液中抗原(百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素)含量与振动前结果差异无统计学意义(t值分别为0.49和0.20~0.80,P值均>0.05);电子显微镜观察结果与振动前比较无明显变化.结论DTacP-sIPV联合疫苗在模拟运输振动条件下稳定性良好.

皮内免疫部分剂量组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗的免疫持久性

目的评价皮内免疫(intradermal,ID)部分剂量组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗(diphtheria-tetanus-acellular component pertussis and Sabin-derived inactivated poliovirus vaccine,DTacP-sIPV)的免疫持久性。方法将40只Wistar大鼠(雌雄各半)分别经ID部分剂量(DTacP-sIPV 1/5和1/10剂量,即1/5D和1/10D ID组)及肌肉注射(intramuscular,IM)全剂量DTacP-sIPV(全剂量IM组),同时设空白对照组(ID PBS)。于0、1、2月共免疫3次,末次免疫后12个月经尾静脉采血,分离血清。微量中和试验法检测抗脊髓灰质炎病毒中和抗体滴度,间接ELISA法检测大鼠血清中抗白喉毒素(diphtheria toxin,DT)、破伤风毒素(tetanus toxin,TT)、百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)的IgG抗体滴度,并计算抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)及抗体阳性率。末次免疫后12个月,经雾化吸入百日咳杆菌气雾进行攻击,攻击时间为30 min,于气雾攻击后2、5、14 d检测各组大鼠白细胞数及肺、气管、鼻部位的菌落克隆形成数(colony-forming unit,CFU)。结果与全剂量IM组比较,1/5D和1/10D ID组脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05),空白对照组各型抗体阳性率均为0。1/5D、1/10D ID及全剂量IM组DT、TT、PT、FHA和PRN的IgG抗体阳性率均为100%,空白对照组IgG抗体阳性率均为0。与攻击后2 d比较,空白对照组大鼠经百日咳杆菌气雾攻击后5 d的白细胞数明显升高(F=3.48,P<0.05),随后开始下降;其他组均随时间的延长保持平稳(F=0.14~1.30,P>0.05)。气雾攻击后,空白对照组大鼠肺部细菌载量明显高于其他3组(F=19.00~206.00,P<0.05),攻击后14 d仍可检测到百日咳杆菌;除空白对照组外,其他3组大鼠肺部细菌载量均于攻击后5 d达峰值,14 d时基本清除,各时间点组间差异无统计学意义(F=1.14~1.25,P>0.05)。空白对照组各时间点气管和鼻部细菌载量略高于其他组,但差异均无统计学意义(F=0.71~3.54,P>0.05);除空白对照组外,其他3组大鼠气管和鼻部细菌载量较接近,差异均无统计学意义(F=0.75~3.41,P>0.05)。结论ID 1/5D DTacP-sIPV可诱导大鼠产生针对疫苗各组分的持久保护性抗体,本研究为ID部分剂量DTacP-sIPV免疫策略的制订提供了实验依据。

云南西双版纳百日咳博德特氏菌分离株抗原基因特征分析

目的比对云南省西双版纳地区新的百日咳临床分离株与疫苗株及其他地区流行的百日咳博德特氏菌基因特征,为百日咳的防控提供科学依据。方法对2019年10—12月从云南省西双版纳州人民医院采集的4株百日咳临床分离流行株进行全基因组测序,利用MegAlign 7.1.0软件确定分离株的ptxP、ptxA、prn、fim3基因型,并与我国无细胞百日咳疫苗株CS株以及NCBI数据库中公开的其他国家和地区流行的百日咳博德特氏菌ptxP、ptxA、prn、fim3抗原基因特征进行对比分析;使用RAxML软件基于对28株百日咳博德特氏菌全基因组SNP构建系统发育树。结果云南西双版纳4株百日咳临床分离株BP-L1、BP-L2、BP-L3、BP-L4基因组比CS株多产生了33~36个插入序列引起的基因重排。4株百日咳临床分离流行株的ptxP、ptxA、prn、fim3基因序列与CS株相似度在99.2%~100%。系统发育树结果显示,CS株与参考株TohamaⅠ聚为1支,形成独立进化分支;近年来全球流行的百日咳博德特氏菌分成2个聚类,BP-L1、BP-L4与多数欧美国家百日咳博德特氏菌聚为1支,主要为ptxP3/ptxA1/prn2型菌株,BP-L2、BP-L3与亚洲国家和地区的流行的百日咳博德特氏菌聚为1支,主要是ptxP1/ptxA1/prn1型菌株。结论云南西双版纳临床分离株与疫苗株相比,主要毒力蛋白基因和进化分支发生了明显变化,与近年来国际流行的百日咳博德特氏菌遗传进化一致。

百日咳鼻内疫苗研究进展

百日咳是由百日咳鲍特菌感染引起的高度传染性疾病。尽管疫苗接种覆盖率很高,百日咳仍对全世界婴幼儿造成致命威胁。现有疫苗提供的低效保护是百日咳防控效果不理想的重要原因。百日咳鲍特菌感染仅限于呼吸道,保护呼吸道黏膜有助于更好地控制百日咳。近年来,多种百日咳鼻内疫苗已被开发用于临床前或临床试验研究,包括百日咳减毒活疫苗、含黏膜佐剂的无细胞百日咳疫苗、全细胞百日咳疫苗、百日咳外膜囊泡疫苗等。本文总结了黏膜免疫在预防百日咳鲍特菌感染中的作用和基于鼻腔黏膜免疫的百日咳疫苗研究进展。

2004-2019年我国百日咳报告病例流行病学特征分析

目的分析2004-2019年我国(未包括香港特别行政区、澳门特别行政区和台湾省)百日咳流行病学特征,为完善百日咳监测体系和修订免疫策略提供数据支持。方法通过国家人口与健康科学数据共享服务平台和国家卫生健康委员会疾病预防控制局收集2004-2019年我国百日咳报告发病数据,并对数据进行描述性流行病学分析。结果2004-2019年我国共报告百日咳病例104276例,年均发病率为0.48/10万;发病数(发病率)从2004年的4705例(0.36/10万)降至2009年的1612例(0.12/10万),然后上升至2019年的30027例(2.15/10万);每年4-9月为发病高峰期,占全年发病55.50%~70.08%。2004-2017年报告发病数中,山东、新疆、四川、河北和陕西发病数占55.87%;<1岁、1岁、2岁、3岁、4岁、5~9岁和≥10岁的发病数分别占53.43%、13.10%、7.46%、5.95%、4.70%、11.86%和3.50%。结论2004-2019年我国百日咳发病呈先降后升的趋势性变化,建议从国家层面完善百日咳监测体系,并对免疫水平下降或婴幼儿接触的高危人群加强免疫。

DTacP-sIPV或DTacP-IPV/Hib基础免疫大鼠后加强免疫百白破联合疫苗Tdap的体液免疫评价

目的观察组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗(DTacP-sIPV)或无细胞百白破-灭活脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTacP-IPV/Hib)基础免疫大鼠后加强免疫破伤风类毒素、降低抗原含量的白喉毒素和无细胞百日咳联合疫苗(Tdap)是否产生免疫加强效果,为候选青少年及成人Tdap疫苗提供临床前研究参考。方法将自主研发的DTacP-sIPV和已上市的DTacP-IPV/Hib按0、1、2月3剂免疫程序分别免疫Wistar大鼠,检测免疫前和每剂次免疫后各组大鼠血清中各组分抗体水平。基础免疫完成10个月后,用候选Tdap加强免疫1次,并检测加强免疫前和免疫1个月、6个月后血清中各组分抗体水平。结果3剂次基础免疫1个月后,DTacP-sIPV组抗白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)、抗破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、抗百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、抗丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和抗百日咳黏附素(pertactin,PRN)抗体的几何平均滴度(GMT,Log2)分别为17.41、18.34、18.11、19.93、13.91,血清阳转率均达到100%;基础免疫10个月后,抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA和抗PRN抗体的GMT分别下降至15.17、14.26、13.60、14.51、10.39,血清阳转率维持在89%以上。Tdap加强免疫1个月后,DTacP-sIPV组和DTacP-IPV/Hib组抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA抗体的GMT分别为16.49和17.26、16.80和17.63、16.70和17.74、18.48和19.26,血清阳转率均达到100%,组间差异无统计学意义(P均>0.05);抗PRN抗体的GMT分别为13.07和11.00,血清阳转率为100%和88%,DTacP-sIPV组高于DTacP-IPV/Hib组(P<0.05)。Tdap加强免疫6个月后,DTacP-sIPV组和DTacP-IPV/Hib组抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA和抗PRN抗体的GMT分别下降至15.74和14.87、15.07和15.14、14.84和15.73、16.62和16.37、11.44和9.96,血清阳转率维持在88%以上。结论候选疫苗Tdap在基础免疫接种DTacP-sIPV和DTacP-IPV/Hib的Wistar大鼠模型加强免疫中可诱导产生良好的体液免疫应答,但抗体滴度随时间推移而衰减。

模拟振动后组分无细胞百白破联合疫苗的稳定性评价

目的评价模拟振动后组分无细胞百白破联合疫苗(diphtheria,tetanus,and acellular component pertussis combined vaccine,DTacP)的稳定性。方法选取3批中国医学科学院医学生物学研究所自主研制的DTacP,根据国家标准GB/T 4857.23-2012规定的方法进行随机振动试验。对振动前后的3批样品进行上清中抗原含量测定、Zeta电位测定、电镜观察、效价测定、鉴别试验、物理检查(外观、装量、渗透压摩尔浓度)、化学检定(pH、铝含量、游离甲醛含量)、无菌检查、特异性毒性检查及毒性逆转试验,评价疫苗的稳定性。结果振动前后,3批DTacP上清中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)及黏附素(pertactin,PRN)抗原含量均值差异均无统计学意义(t=0.16~1.73,P均>0.05),白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)均未检测到絮状反应;Zeta电位均值差异无统计学意义(t=0.40,P>0.05);电镜观察未见明显的结构变化;百日咳、白喉、破伤风疫苗效价均值差异均无统计学意义(t=0.37~0.97,P均>0.05);外观、装量、鉴别试验、无菌检查、特异性毒性检查、毒性逆转试验均未见明显变化;pH、氢氧化铝含量、游离甲醛含量、渗透压均值差异均无统计学意义(t=0.48~1.06,P均>0.05)。结论DTacP在模拟振动条件下稳定性良好。

A群脑膜炎球菌多糖-白喉毒素无毒变异体CRM197结合物的制备及其初步评价

目的制备A群膜炎球菌多糖(Group A meningococcal polysaccharide,GAMP)-白喉毒素无毒变异体CRM197(Cross-reactive material 197)结合物,并分析其理化性质及免疫学特性。方法白喉棒状杆菌C7 M1菌株经发酵培养表达CRM197,表达产物经DEAE-4FF层析柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。用溴化氰(CNBr)活化GAMP,己二酰肼(ADH)为连接剂,在碳二亚胺(EDAC)催化下将GAMP与CRM197共价结合,制备GAMP-ADH-CRM197结合物,经Sepharose 4FF层析柱纯化后,进行各项生化检测,采用免疫双扩散检测结合物的抗原性,将结合物皮下注射ICR小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP的抗体滴度,分析其免疫原性。结果发酵培养20 h时,菌液上清中的CRM197蛋白表达量最高;CRM197以分泌形式表达,纯化后纯度达95%以上,可与白喉类毒素单抗发生特异性反应;GAMP-ADH-CRM197结合物各项生化指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求,与A群流脑诊断血清形成明显的沉淀线,结合物诱生的多糖特异性抗体滴度显著高于多糖组和混合物组。结论成功制备了GAMP-ADH-CRM197结合物,其具有良好的抗原性和免疫原性,为以CRM197为蛋白载体制备脑膜炎球菌结合疫苗奠定了基础。

人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Top10,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性。结果经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36%;纯化的融合蛋白纯度可达95%,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应;与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P<0.05)。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV F1片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础。

CpG ODN佐剂序列IMB-AC5的体外免疫刺激活性分析

目的对CpG ODN候选佐剂IMB-AC5进行体外免疫刺激活性分析。方法以目前国外进入临床研究的两种CpG ODN佐剂序列(Coley 7909和Dynavax ISS1018)为对照,采用~3H-TDR法检测IMB-AC5刺激人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)的增殖活性;流式细胞术分析CD19+B活化细胞表面CD69表达水平;ELISA法检测刺激后GEN细胞产生的IL-6和IFNα水平。结果 3种CpG ODN佐剂均能明显刺激人PBLs的增生,IMB-AC5刺激增生能力优于Dynavax ISS1018,略低于Coley 7909;IMB-AC5活化CD19+B细胞表面CD69表达水平与Coley7909相似,Dynavax ISS1018活化效果略低于前二者;3种CpG ODN佐剂体外活化树突状细胞水平差异较大,且呈明显的剂量依赖,IMB-AC5的最佳活化浓度范围为0.15~1.5μmol/L,Coley 7909的最佳活化浓度范围为<0.25μmol/L,活化效果均优于Dynavax ISS1018。结论 IMB-AC5可作为有效的疫苗候选佐剂,且不低于国外同类佐剂的体外免疫刺激活性。

CpG ODN佐剂序列IMB-AC5联合乙型肝炎疫苗的免疫原性分析

目的评价Cp G ODN佐剂序列IMB-AC5联合乙型肝炎疫苗的免疫原性,以评估IMB-AC5佐剂的应用前景。方法利用市售的单铝佐剂乙型肝炎疫苗,根据相同配比加入3种Cp G ODN（IMB-AC5及Coley 7909和Dynavax 1018）,作为实验组（V-AC5、V-7909和V-1018）,并以乙型肝炎疫苗为对照组,分别免疫BALB/c小鼠,于免疫后2、4、6、8周,经尾静脉采血,第10周处死小鼠采集全血,分离血清,采用乙肝表面抗体试剂盒检测anti-HBs抗体水平,ELISA法检测Ig G1/2a亚型抗体比例;ELISPOT法检测小鼠脾细胞IFNγ表达水平。结果免疫后0~4周内,各组小鼠血清抗体水平均无明显变化,第6周开始呈明显上升趋势,至第8周后趋于平缓;各实验组抗体水平均明显高于对照组（P〈0.05）,V-AC5显示出与V-7909同样良好的体液免疫效果,略优于V-1018。免疫后各实验组小鼠血清中Ig G2a/Ig G1比例明显高于对照组。各实验组小鼠脾细胞斑点数明显高于对照组（P〈0.05）;V-AC5斑点数介于其他两个实验组之间。结论 IMB-AC5佐剂能显著活化B细胞产生抗体并具有刺激细胞免疫的效果,可增强疫苗的免疫原性。

Sabin株脊髓灰质炎病毒经透析处理后病毒回收效果评价

目的采用透析法对Sabin株3个型别的脊髓灰质炎病毒收获液进行透析后的病毒回收效果评价。方法高病毒滴度时,对Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液分别进行透析,比较每个型别病毒收获液透析前后的病毒感染性滴度回收率,及透析后的甲醛清除率;低病毒滴度时,选取101、100、10-1 CCID_(50)/mL 3个滴度的Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒液,分别进行透析,将相同型别及滴度的透析前后样品接种至Hep-2细胞上进行3次传代,比较透析前后细胞病变比率及病毒滴度。结果高病毒滴度时,各型别病毒收获液透析后与透析前相比,样品体积和感染性滴度均未发生较大变化(P>0.05),透析后甲醛清除率达99%以上。101 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,各型别病毒3次传代均能100%引起细胞病变;100 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒第1次传代引起细胞病变比率分别为66%、33%和33%,第2、3次传代均能100%引起细胞病变;10-1 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,3个型别病毒3次传代均不能引起细胞病变。所有细胞病变后检测病毒滴度均在6.0 lgCCID_(50)/mL以上。结论 Sabin株3个型别的病毒收获液经透析后,活病毒的回收率较高,基本无损失,透析法可作为该病毒的纯化方法。

HPV16 L2肽段偶联AP205 VLP的原核表达及免疫原性分析

目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65～71、112～120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究。方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65～71、112～120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205-HPV16ΔL2,转化大肠杆菌BL21(DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性。结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性。结论:成功将HPV16 L2表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达。

4种天然环二核苷酸作为黏膜佐剂的效果比较

目的比较4种不同来源的天然环二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)作为黏膜佐剂诱导小鼠产生免疫应答的差异,以期筛选黏膜免疫候选疫苗佐剂。方法用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作为抗原,分别以4种不同的CDN(c-di-GMP、c-di-AMP、3',3'-cGAMP、2',3'-cGAMP)作为佐剂,于第0、14、28天滴鼻免疫小鼠,20μL/只,每个鼻孔10μL。第3次免疫后第14天,ELISA法检测小鼠血清、鼻灌洗液(nasal lavage fluid,NLF)及肺灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的IgA和IgG水平;ELISpot检测小鼠肺组织和脾组织中分泌IgA、IgG、IFNγ、IL-4或IL-17的细胞数量。结果4种CDN作为黏膜佐剂均能有效提高免疫后小鼠血清、NLF及BALF中IgA和IgG水平;其中,3',3'-cGAMP相较于c-di-AMP可有效提高NLF中IgG水平;与2',3'-cGAMP相比,c-di-AMP和3',3'-cGAMP均可提高血清中IgA的产生;而c-di-GMP在血清中诱导产生的IgG2a水平高于2',3'-cGAMP。c-di-AMP和c-diGMP相较于2',3'-cGAMP和3',3'-cGAMP,能诱导有效的Th1相关免疫反应。结论4种不同来源的CDN可增强小鼠系统性免疫和黏膜免疫应答,c-di-AMP和c-di-GMP能促进Th1和Th17细胞类型的免疫反应,可作为黏膜免疫候选佐剂。