外源乙烯利与1-MCP处理对桑椹中乙烯和花青素相关代谢基因表达的影响

【目的】以桑品种‘嘉陵40号’的桑椹为试验材料,探究乙烯在桑椹发育进程中的作用和乙烯相关基因的表达模式,为今后有效开发桑椹的经济价值和通过分子生物学手段调控桑椹成熟期提供理论依据。【方法】桑盛花期后21天(21DAF)和26天(26DAF),分别用100 mg·L^(-1)乙烯利喷洒桑椹表面,采摘后桑椹经0.5μL·L^(-1)乙烯抑制剂1-MCP熏蒸处理,测定其花青素和总糖含量,并提取桑椹的总RNA及合成cDNA模板,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析乙烯生物合成基因MaACO2和MaACS3,乙烯信号转导基因MaETR1,MaETR2,MaCTR1,MaEIN2和MaEIL2,以及花青素生物合成下游基因MaDFR和MaANS的转录表达。【结果】桑椹经过乙烯利处理后,花青素含量和总糖含量与对照相比都有明显增加,与花青素合成有关的基因表达也受乙烯利上调,经1-MCP熏蒸的桑椹花青素含量和总糖含量与对照相比都有所下降。在21DAF桑椹中,乙烯相关基因的表达经乙烯利处理后显著上调,而对1-MCP具有不同的响应模式,其中,MaACO2,MaACS3以及MaEIL2表达下调,MaETR1,MaCTR1和MaEIN2的表达量在各时段显著上调,MaETR2表达量在12 h无明显变化,其他时段上调。26DAF桑椹中,经1-MCP的熏蒸而下调了乙烯各基因的表达,而乙烯利的处理对各基因表达具有不同的影响,与对照相比,处理后32 h,MaACO2,MaETR1,MaETR2,MaEIN2和MaEIL2的表达上调,MaACS3和MaCTR1的表达则下调。【结论】乙烯利处理能够诱导桑椹乙烯生物合成和花青素生物合成相关基因的上调表达,对乙烯信号转导基因也有一定调控作用,且能促进桑椹花青素和总糖含量的积累,并能加快桑椹的发育进程。乙烯抑制剂1-MCP的熏蒸能抑制乙烯信号转导各元件基因的表达,阻止乙烯信号转导和传递,且抑制桑椹中花青素和总糖含量的积累。

桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶,能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能,本研究构建了p MnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段,它们分别为1518 bp和1429 bp,启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达;MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达,且活性较MnACO2强;MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同,转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱,转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。q RT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后Ma ACO1和Ma ACO2的基因表达量,发现Ma ACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。本研究结果表明,MnACO为诱导型启动子,MnACO1兼具组成型启动子特性,MnACO2兼具组织特异型启动子特性。MnACO1在转基因植株中对胁迫响应能力更强,预示着可将其用来调控改良桑树品种抗逆性靶基因;Ma ACO2可能与果实成熟有关,可将其启动子作为果实特异性启动子对桑椹品质进行合理改良。

桑树ASR基因的克隆及表达特征分析

ASR(ABA-stress-ripening)基因家族广泛参与植物对逆境胁迫的响应过程,并对植物的生长发育及果实成熟等起着重要调控作用。根据川桑(Morus notabilis)基因组数据库中的ASR基因序列设计引物,在杂交桑品种桂桑优62的幼苗中克隆得到一个ASR基因,命名为Ma ASR(Gen Bank登录号:KP636800.1)。Ma ASR编码区全长399 bp,编码132个氨基酸,蛋白质等电点5.20,分子质量32.18 k D。以果叶兼用多倍体桑品种嘉陵40号不同发育成熟期的桑椹为材料,通过实时荧光定量PCR分析显示Ma ASR在果实成熟发育早期的表达量较高,在后期的表达量较低。以桂桑优62幼苗为材料进行实时荧光定量PCR分析的结果表明:Ma ASR在茎和叶中的表达量较高,在根部的表达量最低;幼苗经脱落酸(ABA)、甘露醇处理后根部的Ma ASR表达水平上调,经钨酸钠处理抑制了Ma ASR在根和叶中的表达,经蔗糖与葡萄糖处理使Ma ASR在根和叶中的表达水平上调。推测Ma ASR基因参与桑树果实发育和成熟的调控以及幼苗的生长发育,而且能够响应ABA和甘露醇以及糖类等非生物因子的诱导。

果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析

多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)是一种细胞壁结构蛋白,可以催化果胶分子多聚α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,使细胞壁结构解体,导致果实软化。本文采用q RT-PCR方法,分析不同生长阶段菌丝侵染的油菜叶片中多聚半乳糖醛酸酶基因的表达模式。结果表明:(1)采用RT-PCR从果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)菌核中扩增多聚半乳糖醛酸酶基因c DNA,其全长为1143 bp,命名为CsPG1(Gen Bank登录号为KR296662),编码380个氨基酸残基。根据侵染油菜叶片的表达量,确认CsPG1为基因家族的主效基因;(2)将CsPG1基因连接p ET28a(+)载体并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),获得包涵体形式,但对底物(聚半乳糖醛酸)没有活性的蛋白;(3)最适CsPG1包涵体溶解的尿素浓度6 mol L^(–1),采用缓慢稀释低温复性的方法对重组蛋白CsPG1进行了重折叠复性试验,经高亲和力的Ni-NTA树脂纯化后为得到单一条带,获得可溶性蛋白,复性后的多聚半乳糖醛酸酶比活力为5.02 U mg–1;(4)生物试验表明,CsPG1蛋白能够加速嘉陵40(Morus atropurpurea Roxb.)桑椹的成熟和软化,推测该蛋白与肥大性菌核病菌对桑椹的侵染有关。这一结果揭示了不同果桑品种对菌核病敏感性的差异,为果桑生产中菌核病的防控提供了分子证据。

桑椹肥大性菌核病病原菌生物学特性及流行性

【目的】对桑椹灾害性真菌病害——桑椹肥大性菌核病病原菌,即桑实杯盘菌(Ciboria shiraiana)的生物学特性进行研究,分析其流行性。【方法】采用人工接种、调查等研究方法,对C.shiraiana在无性生长阶段中菌丝侵染能力,菌核的休眠期,有性生长阶段中子囊孢子的结构、释放、数目以及萌发等进行研究,并对菌核萌发的物候期进行调查。【结果】C.shiraiana菌丝对桑雌花没有侵染能力;C.shiraiana菌核具有休眠期,低温处理6周以上的菌核才能萌发形成子囊盘;1个菌核可萌发1–15个子囊盘,直径为1.5 cm的子囊盘能产生高达(5.6–6.3)×10~7个子囊孢子;C.shiraiana子囊孢子在酸性环境中的萌发率明显高于在中性和碱性环境中的萌发率;C.shiraiana菌核萌发形成子囊盘产生子囊孢子的物候期,从1月下旬开始到4月中旬结束,其中在3月中旬萌发子囊盘的数目达到最高值。【结论】桑椹肥大性菌核病属于典型的流行性侵染病,在果桑栽培上容易造成毁灭性危害,生产上必须高度重视该病的防控。