淋巴细胞活性检测方法研究

目的探讨淋巴细胞活性检测最佳方法,以提高检测灵敏度和稳定性,降低本底。方法用传统的实验方法和改进的实验方法分别对不同数量的外周血单核细胞进行检测,比较不同实验方法的准确性、灵敏度和稳定性。结果在不吸除培养基的情况下,传统的DMSO和酸性异丙醇都不能完全融解formazan,影响了检测。传统的酸性SDS能够很好的融解formazan,但是得到的OD值太小,这就降低了检测的灵敏度,容易造成测量误差。而改进的10%SDS溶液能够完全融解formazan,并且得到的OD值适中,能够客观的反应细胞数目的变化,减少数值引起的实验误差。结论用改进10%SDS作为溶解formazan的溶解液,可以准确地反应活细胞的数目变化情况,对淋巴细胞这类悬浮细胞来说,在不吸除上清的情况下进行细胞数目的检测更加方便。

补血方协同转染TCRVβ7.1 PBMC对肿瘤化疗造成骨髓抑制的缓解机制

目的:探讨补血方协同转染TCRVβ7.1 PBMC对肿瘤化疗造成骨髓抑制的缓解机制。方法:采用体外细胞实验建立化疗损伤模型,利用MTT法测定肿瘤细胞的死亡率,利用ELISA法检测造血相关细胞因子的分泌情况。结果:与对照组相比补血方与转染TCRVβ7.1 PBMC组能够明显促进粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的分泌,并且加PBMC组与单纯化疗药组相比能够明显抑制肿瘤的生长。结论:补血方协同转TCRVβ7.1 PB-MC不仅能够对肿瘤细胞起到杀伤作用,且对化疗药所引起的骨髓抑制有一定的缓解作用。

细胞活性检测方法优化

目的在不吸出培养基的前提下,探讨MTT比色实验最佳溶解条件,以提高检测灵敏度和稳定性,降低本底,为悬浮细胞活性检测打下基础。方法在96孔板接种不同密度肿瘤细胞,用MTT比色实验来测定。比较不同溶解液溶解Formazan能力,并与传统溶解液进行比较。结果当用10%SDS（pH4～5）作为溶解液所得OD值与细胞数目很高的相关性,43h后测定与12h后测定所得OD值差异无显著性。结论在MTT实验中,可以用10%SDS（pH4～5）作为溶解Formazan的溶解液,与传统溶解液相比可提高检测灵敏度、稳定性和降低本底。

当归补血汤含药血清制备方案

目的探讨小鼠灌胃给予当归补血汤后含药血清的制备方法。方法 MTT法检测骨髓基质细胞体外培养时胎牛血清(FBS)和小鼠血清(MS)的添加比例[FBS∶MS(%∶%)=10∶0,5∶5,10∶5,5∶10,10∶10,0∶10]。小鼠连续灌胃当归补血汤[20 g/(kg·d)]5 d,末次给药(30、60、90、120、150、180 min)后收集血清,利用MTT法检测其促骨髓基质细胞数目增加的能力来确定最佳取血时间。结果当培养体系中小鼠血清和胎牛血清的比例分别是5%时,骨髓基质细胞数目显著高于其他组(P<0.05)。小鼠最后1次给药60 min后,所得血清随取血时间的延长促骨髓基质细胞增加的能力逐渐增强,超过150min后促进效果呈下降趋势。结论培养体系中小鼠血清和胎牛血清的比例会影响骨髓基质细胞体外的生长状态。小鼠末次灌胃给药150 min后所得血清促骨髓基质细胞增加能力最强,当归补血汤药效成分在给药150 min后,在血清中含量最高。

“生物工程下游技术”教学心得

生物工程下游技术是生物技术专业的必修课之一,是生物技术行业实现产业化的关键之一,如何为社会培养优秀的生物技术人才?本文结合自己的教学实践以及在教学过程中的改革尝试,从理论教学和实验教学两方面探讨如何加强学生学习的主观能动性,如何提高学生发现问题、分析问题和解决问题的能力。

细胞自分泌对小鼠骨髓基质细胞体外培养的影响

目的阐明小鼠骨髓基质细胞体外培养的影响因素,优化骨髓基质细胞体外培养方法。方法以小鼠骨髓基质细胞为研究对象,倒置显微镜和MTT法观察骨髓基质细胞不同接种数目(1×105个/孔,3×105个/孔,5×105个/孔)条件下和相同接种数目不同培养基体积(100、150、200μl)条件下的骨髓基质细胞体外生长状态。制备骨髓基质细胞体外培养条件培养基,观察条件培养基对骨髓基质细胞体外生长状态的影响。结果骨髓基质细胞体外培养7 d,100μl培养体系时,接种1×105个细胞的培养孔基本无基质细胞生长,接种3×105个细胞的基质细胞贴壁约30%左右,接种5×105个细胞的基质细胞贴壁达90%左右。当接种细胞数目为3×105个时,随培养基体积的增多基质细胞数目明显减少(P<0.05),而条件培养基组基质细胞的数目明显多于普通培养基组(P<0.05);当接种细胞数目为5×105个时,培养基体积对基质细胞生长状态基本无影响,条件培养基组与普通培养基组骨髓基质细胞的生长状态无显著差异。结论骨髓基质细胞在体外培养时,接种细胞数目过低会影响自身分泌胞外因子的浓度从而影响其自身的生长;细胞自分泌对自身的生长有促进作用,但是当分泌的胞外因子达到一定浓度后促生长作用将达到平台期。

葛花提取物对急性心肌梗死小鼠心肌的保护作用

目的:阐明葛花对急性心肌梗死小鼠心肌的保护作用及作用机制。方法:结扎小鼠冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型。实验分为生理盐水组,复方丹参组,葛花提取物低、中、高剂量组共5组。通过心肌梗死面积和心肌酶的变化来评价保护效果,通过检测血清中SOD、MDA的含量和心肌中β-ARK1、eNOS基因的表达情况来阐明其作用机制。结果:与生理盐水组比较,葛花提取物能够减少心肌梗死面积(P<0.05),降低血清中心肌酶的含量(P<0.05),同时能够升高血清中SOD的含量(P<0.05),并能降低血清中MDA的含量(P<0.05)和心肌中β-ARK1的表达(P<0.05)。结论:葛花提取物通过升高SOD的含量和降低心肌中βARK1的表达来保护急性心肌梗死心肌。

葛花异黄酮对急性心肌梗死小鼠心肌的保护作用

目的通过小鼠急性心肌梗死模型观察葛花异黄酮对缺血心肌的影响,并探讨其作用机制。方法开胸结扎左冠状动脉前降支建立小鼠急性心肌梗死模型,以丹参注射液为阳性对照,观察葛花总黄酮低、高剂量组对心肌梗死面积、血清心肌酶、血清SOD和MDA含量的影响;并通过RT-PCR的方法,检测葛花总黄酮对缺血心肌β-肾上腺受体激酶1(β-adrenergic receptor kinase,β-ARK1)表达的影响。结果葛花总黄酮可明显缩小小鼠心肌梗死面积,降低血清心肌酶和MDA含量,下调心肌β-ARK1 mRNA的表达,并随着剂量的增加其作用加强。结论葛花总黄酮对急性心肌梗死小鼠心肌有明显的保护作用,其作用机制与其抗氧化损伤及下调心肌β-ARK1mRNA的表达有关。

人趋化因子CCL17和CCL22对CD4及CD8T淋巴细胞亚群的趋化能力比较研究

目的探讨具有同源受体CCR4的趋化因子CCL17和CCL22对CD4和CD8 T细胞亚群的趋化能力。方法首先利用流式细胞术检测健康人外周血中CCR4^+T细胞的比例分布,接着用Mo Flo分选流式细胞仪分选出健康人外周血中的CD4细胞和CD8细胞。利用CCL17和CCL22趋化因子蛋白分别对CD4及CD8细胞进行细胞趋化实验,计算趋化指数。利用流式细胞术检测CCL17和CCL22分别作用CD4及CD8细胞后CCR4受体内化情况,计算受体内化效率。结果外周血PBMC中,CD4细胞CCR4分子的表达水平要高于CD8细胞(P<0.05)。在相同趋化时间内,CCL22对CD4和CD8 T细胞亚群的趋化能力强于CCL17(P<0.05),CCL17和CCL22趋化CD4细胞通过Transwell板的细胞数均多于CD8细胞(P<0.05),但CCL17对2种T细胞亚群趋化能力的差异性要小于CCL22。CCR4受体内化实验证实,相同时间下CCL22比CCL17更容易促使CCR4受体发生内化(P<0.05),对于CD4和CD8 T细胞亚群,CCL22作用后受体CCR4内化程度无显著性差别(P>0.05),而CCL17对CD8细胞的内化作用要强于CD4细胞(P<0.05)。结论 CCL22对CD4和CD8细胞的趋化能力均强于CCL17,而促进受体内化方面,CCL17对CD8细胞的作用更强,CCL22对这2种细胞则无显著差别。

补血方对环磷酰胺所致小鼠血虚模型的影响

目的:观察补血方对环磷酰胺所致小鼠血虚模型的影响。方法:将小鼠分为空白对照组、补血方组、环磷酰胺组、环磷酰胺+补血方组(补血方低、中、高剂量)。给药后观察外周血常规、细胞周期。结果:补血方可改善因化疗药物环磷酰胺导致的小鼠血虚模型各项指标。结论:补血方对化疗药物环磷酰胺治疗具有良好的辅助作用。

决明子中总蒽醌苷元的大孔吸附树脂纯化工艺的研究

目的探索决明子蒽醌苷元的大孔吸附树脂纯化工艺。方法以决明子总蒽醌苷元质量分数和收率为主要考察指标,比较了乙醚和氯仿对蒽醌苷元提取的专属性,考察了大孔吸附树脂S-8、AB-8、X-5、NKA-12、D4020、D-101对决明子蒽醌苷元的吸附和解吸附特性以及纯化能力。结果决明子药粉采用氯仿浸提,上S-8型大孔树脂柱,水洗至中性,乙醇-5%NaOH(4∶1)洗脱,醇碱洗脱液浓缩、酸化处理得到质量分数为42.62%的蒽醌苷元。结论建立了一种蒽醌苷元的纯化工艺,为决明子中蒽醌苷元类成分的工业化生产提供依据。

黄芪总提取物促进PBMC对肝癌细胞的体外杀伤作用

目的观察黄芪总提取物(TAE)与人外周血单个核细胞(PBMC)联用对肝癌细胞株BEl-7402的体外杀伤作用。方法 MTT法及流式细胞术分别检测TAE与PBMC在单独、联合应用情况下对BEL-7402细胞的杀伤活性,Burgi修正公式评价药物联合应用对细胞杀伤效果是否具有协同作用,ELISA法检测TAE对PBMC分泌IFN-γ、TNF-α细胞因子的影响。结果 TAE与PBMC联用对肝癌细胞BEl-7402具有协同杀伤作用。TAE预先与PBMC孵育后两者协同杀伤作用明显增强。TAE可以刺激PBMC分泌IFN-γ、TNF-α细胞因子。结论 TAE可以促进PBMC对肝癌细胞的体外杀伤能力,二者联用具有协同杀伤作用,其作用机制可能是TAE刺激PBMC分泌IFN-γ和TNF-α以增强免疫杀伤能力。

葛根芩连汤含药血清及其主要代谢物对人肝癌Huh7细胞株P38MAPK信号通路的影响

目的研究葛根芩连汤含药血清及其主要代谢物对Huh7肝癌细胞株P38MAPK信号通路的影响和相互关系。方法 MTT法确定含药血清组及各代谢物组给药浓度;荧光定量PCR法检测Huh7细胞P38MAPK信号通路中各基因mRNA转录水平;Western blot法检测Huh7细胞P38MAPK信号通路中各蛋白的表达情况。结果葛根芩连汤含药血清组对P38、JNK的表达有上调作用,对ERK的表达有下调作用;葛根素组对P38、JNK的表达有上调作用,对ERK的表达无影响;大豆苷组对P38的表达有上调作用,对JNK、ERK的表达无影响;大豆苷苷元组对P38的表达无影响,对JNK的表达有上调作用,对ERK的表达有下调作用(P<0.05)。结论葛根芩连汤与葛根素、大豆苷、大豆苷苷元对Huh7P38MAPK信号通路的影响不同,选取葛根芩连汤及其主要代谢物平行研究,更有利于对葛根芩连汤进行深入开发。

特异性TCRαβ基因转染T细胞促进抗肿瘤免疫的研究

目的:研究肝癌特异性TCR基因TCRVα12.2-Vβ7.1转染T细胞后,促进T细胞识别肿瘤抗原,活化抗肿瘤免疫反应的效果。方法:构建重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV,以之感染T细胞并优化最佳感染条件。钙黄绿素染色法检测T细胞对不同肿瘤靶细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。流式细胞术检测T细胞表面FasL表达比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果:成功将TCRVα12.2-Vβ7.1基因片段构建入嵌合型腺病毒载体,获得重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV。感染复数为100时,重组腺病毒有最高转染效率。感染3天后,TCRVα12Vβ7阳性细胞比例超过25%。特异性TCR基因转染有效促进T细胞杀伤AFP阳性肝癌细胞,特异性裂解率显著提高(P<0.001)。特异性TCR基因转染有效促进T细胞诱导靶细胞凋亡(P<0.001)。同时,T细胞表面FasL表达比例上升(P<0.001)。TCR基因转染T细胞作用于AFP抗原阳性靶细胞后IFN-γ分泌显著提高(P<0.001)。结论:重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV成功介导肿瘤特异性TCR基因转染T细胞。TCR基因转染可有效促进T细胞识别抗原阳性肿瘤细胞,并发挥抗肿瘤免疫效应。

加味当归补血方对化疗药物诱导小鼠骨髓抑制的影响

目的:观察加味当归补血方对化疗诱导小鼠骨髓抑制的影响。方法:以阿霉素(盐酸多柔比星)诱导小鼠化疗骨髓抑制模型,以外周血有核细胞数量、骨髓细胞周期变化、红系集落单位发育及外周血清EPO含量评价补血方效果。结果:加味当归补血方应用于化疗小鼠后,通过减少骨髓细胞凋亡,促进骨髓细胞加速向S+G2/M期转化,有效提高了外周血有核细胞及血红蛋白数量,同时可通过促进EPO等细胞因子分泌,提高红系造血祖细胞集落产率。结论:加味当归补血方可有效缓解化疗诱导骨髓抑制,促进红系发育。

新型钌配合物通过内源性线粒体凋亡通路诱导Bel-7402细胞凋亡的机制

目的研究钌配合物Ru-HMIP对肝癌细胞Bel-7402的抑制作用及其机制。方法 MTT法检测RuHMIP对Bel-7402细胞的杀伤作用;流式细胞术检测其诱导细胞凋亡情况;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS);Western blot检测细胞凋亡相关蛋白。结果 RuHMIP对Bel-7402细胞有较强的杀伤效果;其对细胞毒性作用是通过诱导细胞凋亡方式;Ru-HMIP在Bel-7402细胞中产生过量ROS,并且这种作用及其细胞毒性都可被还原剂乙酰半胱氨酸(NAC)所阻断。Ru-HMIP可以破坏Bel-7402细胞线粒体膜电位;上调Bax,下调Bcl-2,同时激活Caspase-9及Caspase-3。结论 Ru-HMIP可以在体外有效抑制Bel-7402细胞增殖,其作用机制是在细胞内诱发过量ROS,继而通过内源性线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。

鸢尾苷元和鸢尾苷的电子结构和光谱性质的含时密度泛函理论研究

采用ab initio的HF和DFT的B3LYP方法,对化合物鸢尾苷元和鸢尾苷基态结构进行优化,分析了前线分子轨道特征和能级分布.用含时密度泛函理论(TD-DFT)和半经验的ZINDO方法,对鸢尾苷元和鸢尾苷的电子光谱进行了研究,发现该物质主要吸收光谱源于分子内的π→π*的电子跃迁.计算结果表明,分子结构改变可影响化合物前线分子轨道分布和吸收光谱,吸电子基使紫外光谱红移.

生物技术药物安全性评价综合性实验项目设计与实践

培养学生的综合素质和创新意识,是实验教学的一个重要目标。文章在实践的基础上,从项目的设计、实施、考核等几方面对生物技术药物安全性评价综合性实验进行了探讨,使学生通过综合性实验对生物技术药物安全性评价能有整体的认识,明晰课程全貌和应用方向,真正体现学以致用。

肿瘤特异性TCRαβ基因转染诱导记忆性T细胞分化及其免疫功能的研究

目的研究特异性TCR基因转染T细胞被肿瘤抗原激活后,记忆性T细胞的分化情况,并明确其表型特征和免疫功能。方法密度梯度离心法分离PBMC,重组TCR腺病毒感染T细胞,流式细胞术检测外源TCR表达效率。AFP表位肽刺激T细胞,流式细胞术检测TCR基因转染T细胞经抗原刺激后,记忆性T细胞标志分子表达。MTT法检测T细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果重组腺病毒载体感染3 d后,外源TCR表达比例接近30%。特异性TCR基因转染可有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化,CD45RO+细胞比例逐渐上升至接近50%。CD45RO+细胞以CD62L–CD44+表型为主。此后CD62L+细胞比例逐渐上升。最终出现分群明显的CD62L+CD44+TCM表型细胞。特异性TCR基因转染能够促进T细胞杀伤AFP+靶细胞,诱导靶细胞凋亡,并促进IFN-γ分泌。抗原预先刺激能够进一步增强TCR基因转染T细胞抗肿瘤免疫效应。结论 TCR基因转染能够有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化。经肿瘤抗原预先刺激的TCR基因转染T细胞将启动记忆性T细胞分化,在再次遭遇表达相同抗原的肿瘤细胞时发挥更为强烈的免疫效应。

加味黄芪补气汤促进肿瘤患者外周血淋巴细胞增殖及活化的研究

目的:研究加味黄芪补气汤对肿瘤患者外周血淋巴细胞的促增殖及活化作用。方法:以黄芪和苦参为主药,辅以适量人参、黄精及甘草,制备加味黄芪补气汤。分离5位肿瘤患者的外周血淋巴细胞,分别将补气汤、黄芪甲苷、氧化苦参碱作用于淋巴细胞。细胞计数法检测各组淋巴细胞增殖情况;ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-2含量;ELISPOT法检测各组细胞分泌IFN-γ的情况。结果:加味黄芪补气汤浓度为2.5、5.0μg/m L(原药冻干物)时能够促进肿瘤患者外周血淋巴细胞增殖,其中浓度为2.5μg/m L时效果最好,与对照组相比具有统计学意义(P<0.01);黄芪甲苷浓度为2.0、4.0μg/m L时能够促进肿瘤患者外周血淋巴细胞的增殖,其中4.0μg/m L时效果最好(P<0.01);氧化苦参碱各浓度对肿瘤患者外周血淋巴细胞的增殖基本无影响(P>0.05);IL-2分泌水平检测显示,加味黄芪补气汤、黄芪甲苷、氧化苦参碱浓度分别为2.5、4.0、8.0μg/m L时,较组内其他浓度效果较好,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);IFN-γ的ELISPOT实验结果显示,加味黄芪补气汤、黄芪甲苷、氧化苦参碱浓度分别为2.5、4.0、8.0μg/m L时,阳性细胞计数最多,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。结论:加味黄芪补气汤在一定浓度范围内能够促进肿瘤患者外周血淋巴细胞增殖与活化,其中黄芪的有效成分黄芪甲苷参与淋巴细胞的增殖与活化过程,而苦参的有效成分氧化苦参碱可能只参与活化淋巴细胞的作用。