丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3与细胞核分离基因C相互作用的研究

目的验证丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(mitogen-activated protein kinase kinase ki-nase3,MAPK/ERK kinase kinase3,MEKK3)与细胞核分离基因C(Nuclear distribution gene C,NudC)的表达产物NudC相互作用的真实性,以及探讨MEKK3是否为NudC的一个上游调控激酶。方法构建了一系列的载体,通过GST-Pull down技术,免疫共沉淀技术,从体外和体内两个方面来验证MEKK3和NudC之间能否相互作用,又利用体外模拟磷酸化实验来证明MEKK3是否为NudC的一个上游调控激酶。结果GST-Pull down以及免疫共沉淀技术显示MEKK3和NudC在体内和体外均能够相互结合,体外模拟磷酸化实验表明在体外野生型MEKK3可以磷酸化NudC,而激酶失活型MEKK3不能。结论MEKK3和NudC之间能够相互作用,而且MEKK3可能为NudC的一个上游调控激酶。

东莨菪碱和阿托品对小鼠胃肠运动抑制作用的研究

目的探索东莨菪碱与阿托品抑制小鼠胃肠运动的差异以及两者的协同作用。方法将小鼠随机分为生理盐水组(Ns)、新斯的明组(Ne)、新斯的明+阿托品组(Ne+At)、新斯的明+东莨菪碱组(Ne+Sc)、新斯的明+阿托品+东莨菪碱组(Ne+At+Sc),每组12只。采用小鼠小肠炭末推进试验,观察各组药物引起小鼠的小肠推进亢进或抑制作用。结果 1)新斯的明+东莨菪碱组的小鼠小肠推进百分率(49.82±3.48)与新斯的明+阿托品组(53.27±11.61)无明显差别(P>0.05);2)东莨菪碱与阿托品联用组(33.65±3.03)比单独运用阿托品、东莨菪碱组的小肠推进百分率明显降低(P<0.01和P<0.05)。结论东莨菪碱与阿托品有协同抑制小鼠胃肠运动的作用。

普罗布考与塞来昔布联合应用对大鼠动脉粥样硬化的影响

目的:探讨普罗布考与塞来昔布联合应用对大鼠动脉粥样硬化的影响。方法:SD雄性大鼠40只,随机分为正常组、模型组、普罗布考组、塞来昔布组及普罗布考与塞来昔布联合组(联合组),每组各8只。正常组给予基础饲料喂养,模型组为建立动脉粥样硬化模型,予以高脂饲料+维生素D3+动脉内膜球囊损伤术,普罗布考组、塞来昔布组、联合组同法造模后分别予以普罗布考、塞来昔布、普罗布考联合塞来昔布灌胃。药物干预12周后,检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),酶联免疫吸附试验法检测血清C反应蛋白(CRP)和正五聚体蛋白3(PTX3),HE染色观察胸主动脉的病理形态改变并计算动脉内膜、中膜厚度及内膜/中膜厚度比。结果:与正常组比较,模型组、普罗布考组、塞来昔布组和联合组的TC、LDL-C、CRP均明显升高(P<0.01);与模型组比较,普罗布考组和联合组的TC、LDL-C、CRP、PTX3均显著降低(P<0.01);与正常组比较,普罗布考组、塞来昔布组和联合组的内膜厚度、中膜厚度、内膜/中膜厚度比均明显增加(P<0.01),普罗布考组、塞来昔布组和联合组与模型组比较,内膜厚度、内膜/中膜厚度比均显著减小,中膜厚度增加(P<0.01)。结论:普罗布考和塞来昔布联合应用可明显降低动脉粥样硬化大鼠血脂和炎性因子水平,有一定的抗动脉粥样硬化作用。

姜黄素对脂多糖诱导的小鼠抑郁样行为的影响及机制

目的研究姜黄素(CUR)抗脂多糖(LPS)诱导的小鼠抑郁作用及机制。方法取雄性ICR小鼠30只,分为Control组、LPS组、CUR组,每组10只。采用单剂量腹腔注射LPS 1 mg/kg建立小鼠抑郁模型。通过糖水偏好实验(SPT)、旷场实验(OFT)和强迫游泳实验(FST)对抑郁小鼠进行行为学评价;尼式染色实验观察小鼠前额叶皮质(PFC)神经元胞体中的尼氏体(Nissl body)变化情况;Western blot实验检测小鼠PFC区c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)、凋亡相关蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达情况。结果 CUR组小鼠糖水偏好度、旷场活动总距离和穿越中心格次数均高于LPS组(P<0.05),FST中小鼠不动时间低于LPS组(P<0.05)。尼式染色实验结果显示CUR组小鼠神经细胞数多于LPS组(P<0.05)。Western blot实验结果显示,与LPS组比较,CUR组小鼠PFC区p-JNK、Bax、Caspase-3表达降低,Bcl-2表达升高(P<0.05)。结论姜黄素可以改善脂多糖诱导的小鼠抑郁行为,减轻神经细胞的损伤,其可能与抑制JNK磷酸化,降低促凋亡蛋白Bax、Caspase-3,提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。

MEKK3蛋白K391位点突变对其影响的生物信息学分析及活性鉴定

MEKK3是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成员,主要参与激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases,JNK)和细胞外调节(extracellular regulated protein kinases,ERK)两条通路。利用生物信息学分析野生型MEKK3(MEKK3WT)及突变型MEKK3(MEKK3K391M)蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、二/三级结构、相互作用蛋白等。结果表明,MEKK3K391M蛋白的稳定性增强,亲/疏水性最强位点未改变,α-螺旋、β-折叠及蛋白结合位点与MEKK3WT不同。三级结构分析显示,MEKK3K391M空间位阻增大。据GenBank提供的人源MEKK3的cDNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3WT目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增突变型MEKK3K391M目的基因,并将其克隆至带有FLAG标签的真核表达载体pCMV-tag-2c中。DNA序列分析结果表明,MEKK3K391M基因序列成功将编码赖氨酸(Lys,K)的密码子AAG突变为编码甲硫氨酸(Met,M)的密码子ATG;免疫印迹分析显示,MEKK3WT、MEKK3K391M重组体均在PC12细胞中高效表达;MEKK3WT可以激活JNK,使JNK发生磷酸化反应,其条带灰度值明显高于对照组和MEKK3K391M组。MEKK3K391M组的P-JNK与对照组相差不大。总之,MEKK3中K391的氨基酸突变引起了蛋白结构和功能的改变,特别是三级结构的空间位阻加大,使MEKK3K391M与ATP结合能力减弱,从而无法呈递磷酸基团催化相应的底物,失去生物学活性。本研究对寻找神经系统疾病JNK通路中与MEKK3相互作用的蛋白分子、探索蛋白相互作用机制提供实验基础。

玉米黄质预先灌胃对脂多糖诱导小鼠抑郁行为的改善作用及其机制

目的探讨玉米黄质预先灌胃对脂多糖诱导小鼠抑郁行为的改善作用及其机制。方法将健康雄性ICR小鼠随机分为对照组、模型组、观察1组、观察2组。观察1组、观察2组分别给予玉米黄质50 mg/kg、100 mg/kg,1次/d,连续灌胃1周。对照组和模型组小鼠给予相同体积的羧甲基纤维素钠,每天1次,连续灌胃1周。在最后一次给药结束12 h后,模型组、观察1组、观察2组单次腹腔注射脂多糖1 mg/kg,制作小鼠抑郁模型,对照组单次腹腔注射等剂量生理盐水。采用旷场实验、悬尾实验检测小鼠抑郁样行为;ELISA法检测小鼠前额叶皮质炎症因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结果给予小鼠脂多糖12 h后,观察1组、观察2组、模型组、对照组活动总距离分别为(17.50±1.870)、(19.50±1.870)、(8.00±1.265)、(21.50±2.881)m,与对照组相比,模型组活动总距离变短(P<0.01);与模型组相比,观察1、2组活动总距离延长(P<0.01)。观察1组、观察2组、模型组、对照组穿越中心格的次数分别为(102±9)、(113±9)、(63±8)、(135±19)次/5 min,与对照组相比,模型组穿越中心格的次数变少(P<0.01);与模型组相比,观察1、2组穿越中心格次数增加(P均<0.01)。观察1组、观察2组、模型组、对照组小鼠不动时间分别为(59.17±7.126)、(51.73±7.092)、(104.40±6.881)、(51.59±4.433)s/4 min,与对照组相比,模型组小鼠不动时间延长(P<0.01),与模型组相比,观察1、2组抑郁小鼠不动时间减少(P<0.01)。与对照组相比,模型组小鼠前额叶皮质IL-1β、IL-6、TNF-α表达升高(P均<0.01);与模型组相比,观察1、2组前述各炎症因子表达降低(P均<0.01)。观察1、2组间上述各指标比较,P均<0.01。结论玉米黄质可能通过下调炎症因子的表达改善脂多糖诱导的小鼠抑郁样行为,以100 mg/kg的剂量为佳。

核酸染色剂对DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移速度的影响

核酸染色应用在许多DNA检测相关的技术领域,然而染色剂结合DNA会造成电泳迟滞。为研究溴化乙锭(ethidium bromide,EB)和GelRed这2种核酸染色剂对DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移速度的影响,分别用这2种染色剂采用前、后染色的方法对DNA进行染色,以琼脂糖凝胶电泳作为检测方法,凝胶成像系统拍照观察,用Reptation理论分析数据。研究结果表明EB和GelRed染色均使DNA迁移发生了滞后,但EB对于目的基因片段大小的判读未受电泳滞后的影响,而GelRed对目的基因判读略有影响。然而,与EB相比,GelRed具有荧光效果强、安全、环保等诸多优点。总之,需要精确鉴定目的基因片段大小可以选择后染色或EB前染色,对于鉴定目的基因片段大小要求不高且需要荧光效果好、环保的染色剂可以选择GelRed。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶突变体MEKK3KI的构建及功能鉴定

有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MEKK3(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于MAP3K(mitogen-activated protein kinase kinase kinase)家族,其在细胞增殖、凋亡、炎症反应、肿瘤的发生中发挥了重要的作用。利用分子克隆手段构建激酶功能失活(kinase inactive)型突变体MEKK3^KI(391位赖氨酸突变为甲硫氨酸,K391→M391)的真核表达载体,并通过检测MEKK3^KI蛋白对NudC的磷酸化作用及对细胞周期的影响以鉴定其生物活性。根据GenBank提供的人源MEKK3的cNA序列(NM203351),扩增出野生型MEKK3(MEKK3^WT)的目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增激酶功能失活型MEKK3^KI目的基因,并将其分别克隆至带有FLAG标签的真核表达载体p CMV-tag-2c和带有GFP标签的真核表达载体pEGFP-C1中。DNA序列分析结果显示,MEKK3^KI基因序列成功将391位点的赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M),表明突变体构建成功;免疫印迹分析显示,MEKK3^WT、MEKK3^KI重组体均在He La细胞中高效表达;体外模拟磷酸化实验结果显示,野生型MEKK3^WT在体外可以磷酸化NudC,而激酶功能失活型突变体MEKK3^KI无法将其磷酸化;激光共聚焦显微镜观察发现,野生型MEKK3在HeLa细胞中过表达,细胞核形态异常,与凋亡细胞核形态相似,而失活型MEKK3过表达不会导致细胞核明显变化。总之,本实验成功构建了野生型、失活型MEKK3的真核表达载体,同时发现其可以磷酸化NudC,促进细胞凋亡,为进一步揭示MEKK3生物学功能奠定了基础。

PB1结构域与细胞信号转导

PB1(Phox and Bem1)结构域是一种约由80个氨基酸残基组成的功能性结构域,主要有3种类型。它存在于许多信号转导蛋白中,并介导这些蛋白之间的二聚化。这些PB1结构域蛋白主要参与两条信号转导通路,即丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路和细胞核因子κB(NF-κB)信号通路。同时,PB1结构域与许多肿瘤如乳腺癌、肺癌的发生发展密切相关。