百合乌药汤对1型糖尿病并发肝损伤的保护作用及其机制分析

目的:考察百合乌药汤(Baihe Wuyao decoction,BWD)对小鼠1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)并发肝损伤的保护作用,并揭示其潜在机制。方法:小鼠70只,随机选取10只作为空白组,其余采用腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导T1DM,成模后随机分为6组:模型组、阳性对照组、BWD各剂量组(15、 5、 2.5、 1.25 g·kg^(-1)·d^(-1))。各组小鼠连续给药6周。检测小鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的含量,及肝组织匀浆超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)的含量;观察小鼠肝脏病理学变化;检测小鼠肝脏中蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)在蛋白水平的表达,检测锰超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)和一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、炎症因子包括肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)、凋亡因子包括(B-cell lymphoma-2,Bcl2)、(Bcl2-associated X protein,Bax)和(Caspase 3,CASP3)在m RNA水平的表达。结果:BWD可改善T1DM小鼠肝组织病理损伤;与模型组相比,各剂量组ALT和AST水平均显著降低(P<0.01或P<0.05),低1剂量组效果更明显;BWD低1剂量可显著上调p-AKT/AKT(P<0.05);低1剂量显著下调MDA、iNOS,上调SOD、Mn-SOD含量(P<0.01或P<0.05);与模型组相比,低1剂量的Bcl2/Bax比值明显增加,Bax、CASP3被下调;低1剂量显著降低TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6和IL-8在基因水平的表达(P<0.01或P<0.05)。结论:BWD可通过抗炎、抗氧化、抗凋亡、促进细胞增殖以及改善胰岛素信号通路发挥对T1DM并发肝损伤的保护作用。

百合乌药汤通过抑制mTOR增强肝脏自噬改善非酒精性脂肪性肝病

目的:考察百合乌药汤对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的治疗作用,并探讨其作用机制。方法:将C57BL/6J小鼠随机分为6组,正常组、模型组、盐酸吡格列酮组(盐酸吡格列酮1.95×10^(-3) g·kg^(-1))、百合乌药汤低、中、高剂量组(1.3、2.5、5.1 g·kg^(-1)),每组8只。采用60%高脂饮食(HFD)饲喂12周后,进行百合乌药汤给药治疗。每日给药2次,连续6周,每周监测体质量。第5周进行葡萄糖耐量(GTT)与胰岛素耐受(ITT)实验;然后处死小鼠取肝脏和血清,同时称量肝脏、附睾脂肪(e WAT)和皮下脂肪(i WAT)质量。检测血清总甘油三酯(TG)、肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。分别用油红O染色、苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色和透射电子显微镜观察小鼠肝脏脂质沉积、病理形态学及超微结构的变化。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测胰岛素信号通路分子:胰岛素受体底物1/2/蛋白激酶B/叉头框蛋白O1(IRS1/2/Akt/Fox O1);糖原合成酶:磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase);脂质代谢相关基因:硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)和肉碱棕榈酰转移酶(CPT-1);纤维化相关分子:α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和纤维化传统信号通路:转化生长因子β_(1)/Smad蛋白2/3(TGF-β_(1)/p-Smad/Smad2/3);炎症因子:白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-11和IL-1β;细胞自噬标志物:微管相关蛋白轻链3B(LC3B)Ⅱ/Ⅰ、螯合体(p62/SQSTM1);及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)在基因水平或蛋白水平的表达。结果:与模型组比较,百合乌药汤降低NAFLD小鼠体质量和肝重(P<0.05,P<0.01),抑制肝脏脂质积累;减轻白色脂肪质量:降低e WAT和i WAT质量(P<0.05,P<0.01),降低血清TG含量(P<0.05,P<0.01);改善肝功能:降低ALT、AST含量(P<0.05,P<0.01);改善肝脏胰岛素抵抗(IR):上调IRS2、磷酸化(p)-Akt/Akt、p-Fox O1/Fox O1(P<0.05)的蛋白表达;改善糖脂代谢紊乱:降低空腹血糖和餐后血糖(P<0.05,P<0.01),改善GTT与ITT(P<0.05,P<0.01),降低Pepck、G6Pase、SCD-1(P<0.01),升高CPT-1(P<0.01)的基因表达;减轻肝脏纤维化:下调α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β_(1)(P<0.05,P<0.01),降低p-Smad/Smad2/3(P<0.05)的蛋白表达;抑制炎症相关因子:降低IL-6、IL-8、IL-11和IL-1β(P<0.01)的基因表达;增强自噬功能:上调LC3BⅡ/Ⅰ(P<0.05),下调p62/SQSTM1、m TOR(P<0.05)的蛋白表达。结论:百合乌药汤通过改善IR和糖脂代谢紊乱、抗炎、抗纤维化等多种途径改善NAFLD,其机制还涉及抑制m TOR介导的信号通路而增强肝脏自噬。

肝特异性敲除Yes相关蛋白基因可通过抗氧化作用改善小鼠的肝纤维化

目的探讨肝特异性敲除Yes相关蛋白(YAP)基因对CCl4诱发的肝纤维化的改善作用机制。方法按照体重将肝特异性敲除YAP基因小鼠随机分为4组:正常-1组、模型-1组、正常-2组和模型-2组,每组10只。模型组小鼠腹腔注射20%四氯化碳制备肝纤维化模型;正常组小鼠注射等量生理盐水。6周后取材。用试剂盒法检测小鼠肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量,用逆转录-聚合酶链和蛋白质印迹法分别检测小鼠肝中YAP以及纤维化因子的基因或蛋白表达水平。结果正常-1组、模型-1组、正常-2组和模型-2组的SOD含量分别为(13.01±3.35),(7.36±1.76),(20.67±2.37)和(17.80±2.17)U·mg^(-1);MDA含量分别为(0.04±0.01),(0.10±0.01),(0.07±0.02)和(0.04±0.01)U·mg^(-1);Collagen fiber1蛋白相对表达分别为1.24±0.52,3.41±0.56,1.19±0.42和1.17±0.52;α-SMA蛋白的相对表达分别为1.30±0.55,3.99±0.49,0.75±0.05和1.12±0.53。模型-1组与正常-1组相比,小鼠肝SOD的蛋白含量明显下降,而MDA、Collagen fiber1和α-SMA的蛋白含量明显增加;模型-2组与模型-1组比较,小鼠肝中SOD的蛋白含量明显上升,而MDA、Collagen fiber1和α-SMA的蛋白表达明显减少。组间比较,上述指标的差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论肝特异性敲除YAP基因可通过抗氧化作用改善CCl4诱发的肝纤维化。

基于系统药理学探讨百合乌药汤对1型糖尿病并发肝损伤的保护作用

目的:基于系统药理学及小鼠1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)模型探讨百合乌药汤对糖尿病并发肝损伤的保护作用。方法:通过中药系统药理数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology,TCMSP)筛选百合乌药汤的活性成分;Swiss Target Prediction数据库结合查阅文献筛选出百合乌药汤的潜在活性成分和药物治疗靶点;通过OMIM、GeneCards数据库获取T1DM并发肝损伤作用靶点;使用Venn2.1获得药物-疾病共同靶点;采用Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-成分-靶点-疾病”网络,借助Network Analyzer功能进行核心药物成分分析;使用STRING数据库进行蛋白相互作用分析(PPI);基于R软件使用Bioconductor生物信息软件包进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析;使用Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-活性成分-靶点-信号通路”整合核心网络分析;采用AutoDock软件对百合乌药汤的潜在活性成分与关键靶标进行分子对接来验证结合性能;最后采用百合乌药汤干预T1DM并发肝损伤小鼠试验进行保肝作用和关键分子靶点的验证。结果:获得百合乌药汤包括植物甾醇、β-谷甾醇、等20个活性成分及589个靶点,与疾病的共同靶点有111个,包括蛋白激酶B1(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK3)等;GO功能富集分析涉及生物过程包括蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正向调节、MAP激酶活性的正向调节等;细胞组分表达过程中涉及膜筏、膜微区等;分子功能相关的过程中主要有跨膜受体蛋白激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等;KEGG通路富集分析涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE、叉头盒子信号通路(FoxO)、PI3K-AKT等信号通路;采用T1DM并发肝损伤小鼠模型验证发现,百合乌药汤可改善T1DM并发肝损伤小鼠肝功能,上调磷酸化AKT蛋白的表达,改善胰岛素抵抗。结论:百合乌药汤可通过多成分、多靶点、多通路的作用特点治疗1型糖尿病。