旋毛虫成虫排泄分泌蛋白组分分析

目的通过"鸟枪法"(shotgun技术)分析旋毛虫(Trichinella spiralis)成虫排泄分泌蛋白(adult worm excretory/secretory protein,AWESP)的组分,寻找其调节人炎症性肠炎的活性成分。方法制备旋毛虫AWESP,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离酶解后,采用shotgun液相色谱-串联质谱系统鉴定,将分析所得的数据通过Masco软件进行数据库检索,完成蛋白的鉴定,并对鉴定出的蛋白从细胞组分、分子功能和生物学途径3个方面进行Gene Ontology(GO)分类。结果 SDS-PAGE分离的旋毛虫AWESP相对分子质量(Mr)约15 000~116 000,质谱分析共获得280个蛋白,通过Masco软件检索已鉴定的蛋白为96种,假定的蛋白为98种,未鉴定的蛋白为86种。已初步发现至少有4种蛋白可能具有潜在的调节人炎症性肠炎的作用,包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶、53 000排泄/分泌抗原和谷胱氨肽转移酶。GO工具分析显示,已鉴定的蛋白具有104种分子功能,参与了363种生物过程。结论经Masco软件检索,旋毛虫AWESP成分复杂多样,已鉴定的蛋白有96种,从已明确的蛋白中初步筛选出4种与调节人炎症性肠炎潜在相关的蛋白。

两种蠕虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠腹腔渗出细胞一氧化氮产生及细胞因子分泌的影响

目的观察两种蠕虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)体外对小鼠腹腔渗出细胞(PEC)一氧化氮(NO)的产生及细胞因子分泌的影响。方法无痛处死BALB/c小鼠10只,收集腹腔内液体,制备渗出细胞(PEC),主要为巨噬细胞。将源自旋毛虫(Trichinella spiralis)及广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)的cystatin(Tscystatin,Accystatin)与脂多糖(LPS)刺激的小鼠PEC共孵育,实验分为RPMI组、LPS组、Accystatin+LPS组和Tscystatin+LPS组,除RPMI组外,其余3组均提前2 h用LPS(2μg/ml)刺激贴壁细胞制备炎症模型,Accystatin+LPS组和Tscystatin+LPS组分别用2μg/ml Accystatin或Tscystatin与LPS刺激后的细胞共孵育,每组6孔,培养24 h后,收集上清,用ELISA和硝酸还原酶法检测上清中α肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10等细胞因子和NO的水平。采用SPSS11.5统计学软件处理实验数据。结果ELISA检测结果显示:Accystatin+LPS组细胞上清中促炎因子TNF-α和IL-6分别为(507.50±66.32)和(1 440.49±77.25)pg/ml,较LPS组的(454.15±53.11)和(1 016.2±115.10)pg/ml明显升高(P<0.05)。Tscystatin+LPS组分别为(296.35±55.30)和(793.54±86.61)pg/ml,较LPS组和Accystatin+LPS组明显降低(P<0.05)。RPMI组和LPS组的IL-10分别为(38.80±6.71)和(53.66±7.72)pg/ml,差异无统计学意义(P>0.05),Accystatin+LPS组和Tscystatin+LPS组的IL-10分别为(149.74±26.01)和(158.76±19.67)pg/ml,较LPS组均明显升高(P<0.05)。Accystatin+LPS组和Tscystatin+LPS组NO水平分别为(12.54±2.12)和(7.95±1.40)μmol/L,较LPS组的(20.18±3.99)μmol/L均明显降低(P<0.05),且Tscystatin+LPS组NO水平低于Accystatin+LPS组(P<0.05)。结论旋毛虫和广州管圆线虫的cystatin均可抑制小鼠腹腔渗出细胞NO释放、上调IL-10的水平,Accystatin明显促进TNF-α及IL-6的分泌,Tscystatin则明显抑制两种细胞因子的水平。