黑枸杞花青素对巨噬细胞RAW264.7炎性与自噬交互作用的影响

为探讨黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7 TLR4/NF-κB炎性通路和mTOR自噬通路交互作用的影响,本实验体外培养RAW264.7细胞,用脂多糖作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7诱导其损伤建造炎症模型,将细胞分为对照组、花青素组(25μg/mL)、脂多糖组(1μg/mL)、花青素(25μg/mL)+脂多糖(1μg/mL)组、脂多糖(1μg/mL)+雷帕霉素(100 nmol/L)组、花青素(25μg/mL)+脂多糖(1μg/mL)+雷帕霉素(100 nmol/L)组、脂多糖(25μg/mL)+BAY11-7082(20μmol/L)组、花青素(25μg/mL)+脂多糖(1μg/mL)+BAY11-7082(20μmol/L)组,利用RT-PCR、Western Blot检测黑枸杞花青素结合mTOR通路抑制剂雷帕霉素(RAPA)和NF-κB抑制剂BAY11-7082处理细胞后相关基因的mRNA和蛋白表达。结果显示:当mTOR被抑制后,与脂多糖+雷帕霉素组对比,花青素+脂多糖+雷帕霉素组TRAF6 mRNA表达水平和NF-κBp65蛋白表达水平下调(P<0.05);当NF-κB被抑制后,与脂多糖+BAY11-7082对比,花青素+脂多糖+BAY11-7082组ULK1 mRNA表达水平下调(P<0.05)。结果表明,黑枸杞花青素具有抗炎作用,且mTOR通路对TLR4/NF-κB通路具有调控作用,mTOR通路可能是自噬调节炎症等免疫反应的信号途径。

黑枸杞花青素通过Ⅲ-PI3K通路调控小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬

为探讨青海柴达木黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬的影响,用CCK-8法检测不同浓度不同时间黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖情况;用Western Blot检测不同浓度黑枸杞花青素浓度诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7后自噬因子LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达情况;用Western Blot检测Ⅲ-PI3K自噬调控通路中Ⅲ-PI3K和Beclin-1自噬因子及其结合3-MA自噬抑制剂后蛋白的表达情况。结果表明,25μg/mL的黑枸杞花青素诱导24 h小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞活力均显著增加(P<0.05),增殖效果最好;随着黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7浓度的提高,LC3-Ⅱ和Beclin-1自噬因子的蛋白表达显著降低(P<0.01);在3-MA作用后,花青素显著降低了Ⅲ-PI3K和Beclin-1的蛋白表达(P<0.05)。试验结果表明,黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的最佳浓度为25μg/m L,时间为24 h。同时黑枸杞花青素能抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬,其调控机理可能与Ⅲ-PI3K自噬调控通路有关。

黑果枸杞花青素对人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬相互作用的影响

为了研究黑果枸杞花青素(Anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr,ALR)对人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬相互作用的影响。将ALR与3-MA(自噬抑制剂)结合,采用Hoechst染色、流式细胞术、qRT-PCR和Western Blot法,测定人肝癌HepG2细胞核形态、凋亡率和凋亡因子(包括JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3)的mRNA表达及蛋白表达情况。将ALR与AG490(凋亡通路抑制剂)结合,使用qRT-PCR及Western Blot法检测人肝癌HepG2细胞自噬因子(LC3、LC3-Ⅱ)的mRNA表达及蛋白表达情况。结果表明:ALR结合3-MA后可诱导人肝癌HepG2细胞核出现明显的凋亡形态变化,提高人肝癌HepG2细胞凋亡率,显著抑制JAK2、STAT3的mRNA表达(P<0.05),显著抑制p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达(P<0.05);ALR结合AG490后可显著提高LC3的mRNA表达及LC3-Ⅱ的蛋白表达(P<0.05)。综上所述,抑制细胞自噬可促进ALR诱导的人肝癌HepG2细胞凋亡,促进人肝癌HepG2细胞凋亡可增强细胞自噬。

黑枸杞花青素对LPS诱导的Raw264.7细胞炎症的影响

探讨黑枸杞花青素对脂多糖(LPS)作用下的小鼠Raw264.7细胞的影响及作用机制。体外培养小鼠巨噬细胞Raw264.7,脂多糖作用于小鼠巨噬细胞Raw264.7诱导其损伤建造炎症模型,细胞分为对照组、花青素组、LPS组、花青素+LPS组。ELISA检测各组细胞中IL-6、IL-10、TNF-α和INF-γ的含量的变化;RT-PCR测定相关因子mRNA表达;Western blot法检测各组中TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平。黑枸杞花青素可以抑制LPS诱导的细胞促炎因子IL-6、TNF-α和INF-γ的mRNA的表达(P<0.05),同时能不同程度的抑制细胞上清中IL-6、TNF-α和INF-γ的分泌量(P<0.05);除此之外,经黑枸杞花青素处理后,LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞中,TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平极显著降低(P<0.01)。黑枸杞花青素可抑制LPS诱导的小鼠Raw264.7细胞炎症,其机制可能与调节TLR4/NF-κB信号通路有关。

基于AMPK-mTOR信号通路探讨黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬的影响

通过AMPK-mTOR通路探讨黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬的影响及相关机制。利用MDC染色检测黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体的影响,通过qRT-PCR、Western blot检测黑果枸杞花青素结合通路抑制剂对AMPK-mTOR通路关键因子mRNA和蛋白的表达。结果显示,黑果枸杞花青素可抑制自噬体的聚集,极显著下调AMPK因子的mRNA和p-AMPK的蛋白表达(P<0.01),并极显著上调mTOR因子的mRNA和p-mTOR的蛋白表达(P<0.01);结合雷帕霉素作用后,黑果枸杞花青素极显著下调了AMPK因子的mRNA表达和p-AMPK的蛋白表达(P<0.01),但mTOR因子的mRNA和p-mTOR的蛋白表达差异不显著(P>0.05)。结果表明,黑果枸杞花青素可以抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬,且可能是通过AMPK-mTOR信号通路关键因子AMPK进行调控。

菊苣酸(CA)对LPS诱导的牦牛PBMC细胞炎性因子分泌及表达的影响

为了探究菊苣酸(chioric acid,CA)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的牦牛外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)炎性相关因子分泌及转录水平的调节作用,用Ficoll法分离牦牛PBMC,体外将PBMC与LPS和CA共同培养,通过CCK-8法筛选LPS最佳刺激浓度,ELISA试剂盒检测CA对炎性相关因子含量的影响,实时荧光定量PCR法检测炎性相关因子mRNA表达情况。结果表明,CCK-8法筛选的LPS最佳致炎质量浓度为1.0 mg/L。与对照组相比,CA处理组显著提高IL-10的含量(P<0.05),LPS处理组显著提高IL-6和IL-1β的含量(P<0.05),极显著提高了IL-8、TNF-a和INF-γ的含量(P<0.01);与LPS处理组相比,CA+LPS处理组IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-a和INF-γ的含量均显著降低(P<0.05),但IL-10的含量显著升高(P<0.05)。同时,与对照组相比,CA处理组显著降低IL-1βmRNA表达(P<0.05),显著升高IL-10 mRNA表达(P<0.05),LPS处理组极显著升高IL-6、IL-8、IL-1β、INF-γ和TNF-αmRNA表达(P<0.01);与LPS组相比,CA+LPS处理组IL-6、INF-γ和TNF-αmRNA表达显著降低(P<0.05),IL-8和IL-1βmRNA表达极显著降低(P<0.01),IL-10 mRNA表达显著升高(P<0.05)。上述结果说明,CA可通过调节牦牛PBMC炎性因子的分泌及表达,从而发挥抗炎作用。