GRP78在伪狂犬病病毒感染过程中的作用研究

为探究热休克蛋白70家族成员葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在伪狂犬病病毒(PRV)感染宿主过程中的作用,本研究利用PRV Min-A株感染PK-15细胞后,采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测GRP78蛋白的表达和亚细胞定位情况,western blot结果显示,与对照组相比,PRV感染组的GRP78蛋白水平未见明显变化;IFA结果显示,PRV感染组细胞膜上GRP78的荧光强度明显增加。进一步通过生物素标记细胞膜蛋白,然后利用磁珠分离细胞膜蛋白,经western blot检测结果显示,PRV感染组细胞膜中GRP78的蛋白水平显著高于未感染PRV的对照组(P<0.05)。可见PRV感染不影响细胞内GRP78蛋白的表达,但能够增加GRP78在细胞膜中的含量。利用GRP78多克隆抗体(pAb)与PK-15细胞共孵育1 h后感染PRV,经空斑试验检测细胞上清中的病毒滴度,结果显示,与对照组相比,GRP78 p Ab孵育组的病毒滴度未见明显变化,表明GRP78并不是PRV侵入宿主细胞的关键因子。通过IFA检测GRP78与PRV在细胞中的共定位情况,结果显示,GRP78与PRV在细胞膜上无共定位,但二者在细胞质中有共定位。分别在PK-15细胞中下调或者过表达GRP78后感染PRV,采用western blot和空斑试验分别检测细胞内PRV的蛋白合成和细胞上清中的病毒滴度,结果显示,GRP78下调后PRV蛋白和病毒滴度显著低于对照组(P<0.05),而过表达GRP78组的病毒滴度明显高于对照组,表明GRP78参与调节PRV的释放。本研究首次表明GRP78作为一种重要的宿主因子参与调节PRV从宿主细胞内的释放,该结果为进一步研究PRV与宿主细胞的相互作用提供了参考依据。

猪伪狂犬病病毒SX-2018变异株的分离鉴定及其致病性研究

本研究从疑似暴发伪狂犬病(pseudorabies,PR)猪场死亡的仔猪中分离到1株病毒,经组织病理学剖检、PCR试验、Western-blot分析,将其鉴定为伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),遂被命名为SX-2018,该病毒在MDCK细胞上具有较强的适应性。将SX-2018株gE基因的序列与国内外21株PRV参考序列进行同源性比较,结果显示,SX-2018株gE基因与国内外参考毒株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.9%,氨基酸同源性为94.5%~100%。遗传进化分析显示,SX-2012株与我国近几年新分离的猪伪狂犬变异毒株处于同一分支;并且与经典株相比,gE蛋白在第48位和第492位各有1个天冬氨酸的插入。为了进一步探讨SX-2018毒株的致病性,将SX-2018株和Min-A株分别感染BALB/c小鼠,分析两组小鼠的发病特征和组织损伤情况;结果显示,SX-2018组的小鼠死亡时间早于Min-A组;并且Min-A组小鼠的肺脏主要表现为间质性肺炎,而SX-2018组的小鼠以出血性肺炎为主。荧光定量PCR分别检测两组小鼠肺脏内PRV gI基因和炎症相关因子的变化;结果显示,SX-2018组小鼠肺组织内的gI基因以及炎症相关因子的mRNA水平显著地高于Min-A组小鼠。以上结果表明,本文成功分离到1株PRV变异毒株,并且与PRV经典株Min-A株相比,新分离的变异毒株可以诱导不同程度的病理损伤和炎症反应。