表达长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的优化表达长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的CHO细胞培养工艺,并进行初步工艺放大。方法采用7 L生物反应器培养表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞,操作参数:转速200 r/min,温度37℃,pH 7.2±0.1,溶氧值(DO)40%。通过改变对数增长期的pH(7.2±0.1降至6.9±0.1)及平台期降温幅度(37℃降至30及33℃),检测培养过程中细胞密度、细胞活率、培养液渗透压、葡萄糖及乳酸水平、以蛋白表达量为指标,优化7 L生物反应器培养工艺。应用优化的最佳工艺进行14 L线性放大,通气量分别设置为0.5、0.1及0.03 SLPM,检测蛋白表达量。结果7 L生物反应器培养工艺最佳pH为6.9±0.1,最佳温度为33℃,该工艺下蛋白表达量高达1200 mg/L;14 L生物反应器培养工艺最佳通气量为0.03 SLPM,该工艺下蛋白表达量为880 mg/L。结论成功优化了表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞7 L生物反应器的培养工艺,并实现了14 L生物反应器的放大,本实验为后续rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了基础。

表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的传代稳定性分析

目的分析表达重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的传代稳定性,确定细胞的生产稳定代次。方法取表达rhGH-fc融合蛋白的CHO细胞(35代),连续传代建立50、70、90代细胞库。复苏各代次细胞并进行培养表达,绘制不同代次的细胞生长曲线,比较不同代次细胞在对数生长期的比生长速率;培养结束,对不同代次细胞表达的蛋白进行亲和层析纯化,比较其表达量,Western blot法对表达蛋白进行鉴定,通过对目的基因mRNA测序比较目的基因的稳定性。结果 50和70代细胞与35代相比,生长曲线基本重合,90代细胞曲线出现差异;50、70、90代细胞在对数生长期的比生长速率与35代相比,差异均无统计学意义(P>0.05),但90代的P值已明显降低;50和70代细胞重组蛋白表达量与35代相比,差异均无统计学意义(P> 0.05),但90代细胞重组蛋白的表达量下降比例达42%;各代次细胞rhGH-Fc基因序列保持稳定,与理论一致。结论表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的生产稳定代次为70代,可满足后续研究和生产需要。