高糖环境下抑瘤素对人皮肤成纤维细胞增殖和细胞外基质分泌的影响

目的探讨高糖环境下抑瘤素(oncostatin M,OSM)对人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)增殖和细胞外基质分泌的影响及其可能的作用机制。方法(1)高糖模型建立:人皮肤成纤维细胞分为5组,分别给予5、10、15、20、25 mmol/L葡萄糖处理;采用MTT检测高糖培养24、36、48 h各组细胞的增殖活力,Western blot检测对照组(5 mmol/L葡萄糖)和高糖组(20 mmol/L葡萄糖)细胞培养24、36、48 h后ERK、p-ERK和CyclinD1蛋白表达。(2)探讨OSM对高糖模型作用的最佳浓度:细胞分为5组,对照组给予20 mmol/L葡萄糖处理,其余各组分别给予20 mmol/L葡萄糖+25、50、100、200 ng/mL OSM处理;采用MTT检测各组细胞培养24、36、48 h后的增殖活力;Western blot检测各组细胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin蛋白表达。(3)探讨OSM对高糖模型的作用的机制:将细胞分为对照组、高糖组、高糖+OSM组、高糖+OSM+抑制剂PD98059组。流式细胞仪测定各组细胞周期,Western blot检测ERK、p-ERK、CyclinD1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin等相关因子的蛋白表达,q-PCR验证各组细胞ERK1/2、CyclinD1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin基因相对表达量的差异。结果与对照组比较,经20 mmol/L葡萄糖处理后,HDFs的增殖活力显著降低(P<0.001),G1期细胞增多(P<0.01),S期细胞显著减少(P<0.01);ERK、p-ERK、CyclinD1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。与高糖组比较,100 ng/mL OSM处理高糖组48 h后,细胞的增殖活力显著增高(P<0.001);G1期细胞减少(P<0.05),S期细胞显著增多(P<0.05);ERK、p-ERK、CyclinD1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin的蛋白表达显著增高(均P<0.01);q-PCR结果与Western blot结果基本一致,差异均有统计学意义(P<0.05)。当ERK通路特异性小分子抑制剂PD98059阻断ERK信号通路后,上述效应显著减弱(P<0.05)。结论OSM可能通过ERK信号通路逆转高糖对HDFs增殖和细胞外基质分泌的抑制作用。

BMSC共培养对人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的影响

该实验探究人骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC)能否通过旁分泌作用影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast, KF)中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)的表达,从而影响TGF-β/Smad信号通路。培养BMSC、KF及正常人皮肤成纤维细胞(normal human skin fibroblast, NHDF),使用0.4μm微孔孔径的悬挂式细胞培养皿构建BMSC与成纤维细胞之间非接触的细胞间接共培养模型。通过免疫荧光、激光共聚焦技术、Western blot和qPCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况。Western blot和qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子TGF-β1、Smad7的表达。在成功构建共培养模型后,利用细胞免疫荧光和激光共聚焦技术, Western blot及qPCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况,结果显示, DNMT1在KF中高表达而在NHDF中呈低表达,共培养组KF较非共培养组DNMT1的蛋白和m RNA水平表达明显降低(P<0.01)。利用Western blot, qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子的表达,结果显示较非共培养组,共培养组KF中TGF-β1在蛋白水平表达显著降低(P<0.01),抑制性蛋白Smad7在m RNA水平表达增高(P<0.05)。研究证实,人BMSC可能通过旁分泌作用抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞中DNMT1的表达,从而抑制TGF-β/Smad信号通路,使瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖趋于正常。