Xfect介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3高效转染Vero细胞的方法及其条件的优化

旨在用Xfect试剂介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3转染Vero细胞,以期获得转染效率较高的方法,并检测目标片段的表达,从而为进一步研究HSV-2 LAT基因及其ORF3片段的生物学功能奠定基础。用Xfect试剂介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3转染Vero细胞,48 h后观察荧光表达情况,并计算不同转染方法分别在有无血清及质粒与Xfect Polymer比例不同时的转染效率。用RT-PCR检测ORF3片段在Vero细胞中的表达。结果显示,采用贴壁转染法,在有血清及质粒与Xfect Polymer比例为5μg/2μL时转染效率较高;RT-PCR可以获得目的条带,证明ORF3片段在Vero细胞中得到表达。本试验获得的优化条件可以显著提高Xfect Polymer对Vero细胞的转染效率;以绿色荧光蛋白作为标签鉴定目的基因在细胞中表达的方法切实可行。

pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

克隆单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virusⅡ,HSV-2)潜伏相关转录体(latency associated transcript,LAT)第3个开放阅读框(open reading frame3,ORF3)的DNA序列,构建pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体,并观察其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达,为进一步研究LAT基因及ORF3的生物学功能奠定基础。用HSV-2333株感染Vero细胞,从Vero细胞培养液中收集HSV-2并提取HSV-2基因组。以HSV-2基因组为模板,PCR扩增得到HSV-2LAT ORF3DAN片段。将ORF3片段连接到pEGFP-C2质粒上,用卡那霉毒筛选阳性克隆,经菌落PCR,双酶切及测序验证pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体构建成功。用Xfect转染试剂将重组载体转染入Vero细胞,倒置荧光显微镜观察其在Vero细胞中的表达。双酶切及测序结果验证ORF3片段正确插入pEGFP-C2质粒,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中的表达。成功构建pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体,该重组质粒能在Vero细胞中成功表达。

HSV-2多功能蛋白ICP27真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

目的构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)多功能蛋白感染细胞多肽27(ICP27)真核表达载体pCDNA3.0-ICP27,并检测其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达。方法提取病毒株HSV-2333 DNA,用高保真DNA聚合酶对多功能蛋白ICP27基因进行高保真扩增,用双酶切连接至真核表达载体pCDNA3.0中。pCDNA3.0-ICP27经双酶切、测序验证,并通过脂质体介导质粒瞬时转染Vero细胞,经RT-PCR和Western blot检测ICP27蛋白的表达。结果 pCDNA3.0-ICP27经双酶切可切出目的片段,测序结果经比对,与基因库中的序列完全一致。转染后经RT-PCR和Western blot检测,证实转染重组质粒组有ICP27蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到ICP27的表达。结论成功构建了HSV-2多功能蛋白ICP27真核表达载体pCDNA3.0-ICP27,并能在Vero细胞中表达。

中波紫外线对人血小板线粒体活性影响的初步观察

目的:观察中波紫外线对人血小板线粒体活性的影响,探讨其作为评测光损伤敏感系统的可行性。方法:以不同能量的中波紫外线照射人血小板,观察血小板计数(PLT)、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板比容(PCT)、血小板平均体积(MPV)、血小板细胞活性、线粒体活性的变化。结果:接受不同能量的中波紫外线照射血小板,其血小板计数、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板比容(PCT)、血小板平均体积(MPV)、血小板生物活性均无明显变化(P>0.05),而线粒体活性则明显降低(P<0.05)。结论:人血小板线粒体活性对中波紫外线的照射敏感并与其剂量呈依赖关系,可很好反映中波紫外线对生物体光损伤作用。

中波紫外线对人血小板线粒体DNA影响的初步观察

目的:观察中波紫外线对人血小板线粒体活性及线粒体DNA的影响,探讨其作为评测光损伤敏感系统的可行性。方法:以不同能量的中波紫外线照射人血小板,观察血小板线粒体活性及线粒体DNA光化产物环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)含量的变化。结果:接受不同能量中波紫外线照射的血小板,线粒体活性明显降低(P<0.05),环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)含量则明显增加(P<0.05)。结论:人血小板线粒体活性与环丁烷嘧啶二聚体含量对中波紫外线的照射敏感,并与其剂量呈依赖关系,可很好反映中波紫外线对生物体光损伤作用。

三种方法检测生殖器疱疹病毒的比较

近年来生殖器疱疹发病率逐渐上升，^1其临床表现多样，且无症状者多见，有症状时，传染性强；无症状感染者及复发性生殖器疱疹复发的间歇期存在排毒，也可能具有传染性。。我们采用ELISA、细胞培养和PCR法对84份生殖器疱疹标本进行了检测，现将结果报道如下。

pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体在Vero细胞中的表达特性及其对细胞活性的影响

目的:研究单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框3(ORF3)的表达特点及其对细胞活性的影响。方法:双酶切和测序验证本实验室构建的HSV-2 LAT ORF3真核表达载体pEGFP-C2/LAT-ORF3的可用性,并将其转染入vero细胞,通过荧光和RT-PCR检验其在细胞中的表达,用MTT法进行细胞活性分析。结果:融合蛋白在细胞核中大量集中,且影响了绿色荧光蛋白在细胞中的分布;重组质粒对Vero细胞没有损伤作用。结论:HSV-2 LAT ORF3可抵消空质粒对细胞的损伤作用;其作用靶点可能主要存在于细胞核中,为阐明HSV-2 LAT ORF3在潜伏复发中的功能提供了实验基础。

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体开放读码框3对Vero细胞凋亡的影响

目的研究单纯疱疹病毒2型（HSV-2）潜伏相关转录体（LAT）开放读码框3（ORF3）对顺铂诱导的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）凋亡的影响。方法构建重组质粒pEGPF—ORF3，并转染Vero细胞，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）验证目的基因的表达。顺铂诱导Vero细胞凋亡，通过荧光显微镜观察凋亡小体，Giemsa染色检测细胞核形态，噻唑蓝法（MTr法）检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。实验结果采用SPSSl3．0进行分析，各组间两两比较采用单因素方差分析和t检验。结果成功克隆HSV-2333株ORF3基因，构建pEGFP—ORF3真核表达载体，RT—PCR验证该真核表达载体能在Vero细胞中高效表达。转染pEGFP—ORF3的Vero细胞经顺铂诱导凋亡后Giemsa染色，显示胞核蓝染，胞质淡浅，细胞形态正常。M．rr法分析显示，细胞增殖在转染pEGFP—ORF3组（2．56±0．21）与未经任何处理的正常对照组（2．66±0．13）比较，差异无统计学意义（P〉0．05），但高于顺铂诱导凋亡的正常对照组（1．65±0．11）和pEGFP—C2组（1．56±0．18），差异均有统计学意义（P〈0．05）；流式细胞仪分析细胞凋亡率，转染pEGFP—ORF3组（4．03％±1．04％）与正常对照组（2．13％±0．09％）比较，差异无统计学意义（P〉0．05），但低于空质粒pEGFP—C2组（19．45％±2．05％），且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HSV-2LATORF3在Vero细胞中具有抗顺铂诱导的凋亡作用。

单纯疱疹病毒Ⅱ型ICP27对Vero细胞凋亡作用的研究

目的探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型转录前蛋白ICP27对Vero细胞凋亡作用及其参与细胞凋亡的可能途径。方法用前期构建成功的pcDNA3．0-ICP27质粒瞬时转染Vero细胞，MTr法检测pcDNA3．0-ICP27转染Vero细胞的活性，Giemsa染色及流式细胞术检测转染后ICP27在细胞凋亡中的作用，实时荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2mRNAs的变化和对凋亡执行蛋白Caspase-3的活性的检测以探讨ICP27参与细胞凋亡的途径。结果pcDNA3．0-ICP27转染Vero细胞后，M1Tr法检测发现其活性明显低于转染pcDNA3．0及空白转染的Vero细胞活性；Giemsa染色后发现转染pcDNA3．0-ICP27的Vero细胞变圆，细胞核破裂，流式细胞检测发现pcDNA3．0-ICP27转染的Veto细胞发生的凋亡率更高。凋亡执行蛋白Caspase-3的活性明显高于转染pcDNA3．0及空白对照；荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2mRNAs的变化，转染重组质粒的Vero细胞中BaxmRNAs表达量上调，Bcl-2mRNAs表达降低，Bax／Bcl-2明显高于正常培养的Vero细胞及转染pcDNA3．0质粒的Vero细胞。结论ICP27对Vero细胞有促进细胞凋亡的作用。而这种作用可能是使Bax及Bcl-2在细胞中的比例发生变化而导致的。

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录本开放读码框的表达及其抗凋亡功能分析

目的:研究单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体(LAT)开放读码框(ORF)对凋亡诱导剂诱导Vero细胞凋亡的影响。方法:PCR扩增LAT ORF1、ORF2、ORF3片段,构建重组质粒pEGFPORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3,重组质粒pEGFP-ORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3转染Vero细胞;RT-PCR鉴定ORF1、ORF2、ORF3的表达。用凋亡诱导剂放线菌素D、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导Vero细胞凋亡,通过荧光显微镜观察细胞形态学的改变,MTT检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:双酶切和测序确认pEGFP-ORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3构建成功,RT-PCR表明这3个真核表达载体能在Vero细胞中高效表达。转染各种pEGFP-ORF的Vero细胞经凋亡诱导剂诱导后,细胞形态正常。MTT结果表明转染了各种重组质粒pEGFP-ORF的Vero细胞经凋亡诱导剂诱导后Vero细胞活性与未经任何处理的正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),但高于凋亡诱导剂诱导凋亡的Vero细胞组及与转染空质粒pEGFP-C2,且经凋亡诱导剂诱导的Vero细胞组,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术结果表明,转染各种重组质粒pEGFP-ORF且经凋亡诱导剂诱导凋亡组与正常对照组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),而显著低于转染空质粒pEGFP-C2且经凋亡诱导剂诱导凋亡组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HSV-2 LAT ORF对凋亡诱导剂诱导的Vero细胞的凋亡具有抵抗作用。

顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型的建立

目的:建立常见凋亡诱导剂顺铂(Cisplatin)诱导非洲绿猴肾细胞(Vero)凋亡的模型,为进一步研究抗凋亡基因在细胞凋亡中的分子机理打下基础。方法:分别以不同浓度的顺铂处理Vero细胞48h,用噻唑蓝(MTT)比色法、Gimesa染色、流式细胞术检测,观察处理后细胞的生长活力和凋亡情况。结果:以未处理的细胞作为对照组,1、2、3、4、5μg/mL的顺铂处理的Vero细胞生存率分别为(79.02±6.10)%、(68.84±4.42)%、(56.66±4.07)%、(46.83±3.76)%、(29.04±5.93)%(P<0.01);经顺铂诱导后细胞形态学发生明显改变,出现膜小泡和凋亡小体形成等凋亡细胞特征;流式细胞仪检测,0、1、2、3、4、5μg/mL的顺铂处理的Vero细胞后凋亡率分别为1.66%±0.19%、16.65%±1.26%、24.82%±1.03%、36.22%±1.04%、48.49%±1.24%、43.34%±1.17%(P<0.01)。结论:本实验成功建立顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型,将有助于进一步探讨目的基因在Vero细胞凋亡作用的的分子机制。